Арт. L-SPI
Когда Филиппу Лайссу, биологу и директору факультета биовизуализации в британском университете Эссекса, впервые было предложено получить изображения кораллов, его первой мыслью было использование для этой задачи лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Прорисовывались изображения удивительных структур, но, как отметил Филипп Лайсс: «Я мог взглянуть на образец только один раз, после этого он просто сгорал».
После тестирования более низких уровней освещенности при контроле окружающей среды, он переключился на широкопольную микроскопию и вскоре стал наблюдать за коралловыми полипами, появляющимися из их защитных известняковых скелетов. Результаты были лучше, но несмотря на попытки использования деконволюции, Лайсс просто не мог различить сложные трехмерные структуры кораллов.
«Я осознал, что если бы я мог объединить 3D разрешение конфокального микроскопа со слабым освещением широкопольной микроскопии, то это дало бы мне лучшее из обоих методов» - подчеркивает он. «И я знал, что единственный способ сделать это - использовать микроскопию плоскостного освещения».
В то время коммерческие установки для микроскопии плоскостного освещения и платформа для микроскопии плоскостного освещения с открытым доступом OpenSPIM, используемые для визуализации моделей эмбрионов, не были совместимы с крупными коралловыми фрагментами Лайсса.
Рис. 1. Изображение кораллового скелета. Шкала 200 мкм. (Ф.Лайсс)
Все варианты были слишком фототоксичными, и подготовка образца для микроскопа с селективным плоскостным освещением открытого доступа включала размещение живых эмбрионов в среде с низкой вязкостью внутри полимерных пробирок. Очевидно, что это никогда не сработало бы для рифовых кораллов.
«Образец коралла должен расти так, как если бы он находился на рифе, поэтому, чтобы приспособиться к размеру образца и фототоксичности, я понял, что мне придется создать свой собственный микроскоп» - говорит Лайсс: «Как биологу без базы в области физики, это было немного пугающим".
Тем не менее, используя OpenSPIM в качестве отправной точки и опираясь на многие другие онлайн-проекты с открытым исходным кодом, включая программное обеспечение Micro-Manager с открытым исходным кодом для микроскопии, Лайсс приступил к работе.
«Учитывая размер фрагментов кораллов, я знал, что мне нужен широкий плоский луч света, и в конце концов понял, что вращающееся зеркало подойдет для этой задачи» - говорит он. «Я помню, как потрошил лазерный принтер, чтобы его получить, а затем обнаружил, что это действительно хорошо работает и дает очень широкий луч света».
Вскоре Лайсс получил стипендию Королевского общества для разработки модуля плоскостного освещения. Выделенные средства были использованы для закупки оптомеханических компонентов, столешниц, линз и многого другого оборудования компании Thorlabs и других поставщиков. По его словам: «Эти средства дали мне возможность опробовать множество различных деталей, что было очень важно, и создание прототипа с доступными компонентами было важным первым шагом».
Рис. 2. Слева: при использовании обычного микроскопа (конфокальный лазерный сканирующий микроскоп) коралловый полип полностью сжимается из-за высокой интенсивности света. Справа: полип полностью проявился при мягком освещении изготовленного на заказ флуоресцентного микроскопа с плоскостным освещением. Шкала показывает минимальное расстояние. (Nature Methods vol.14, 2017).
Разработав свой прототип, Лайсс объединил усилия с инженерами-проектировщиками британского производителя научных приборов Cairn Research, чтобы создать систему, которая сейчас известна, как система освещения с большой селективной плоскостью (Large Selective Plane Illuminator - L-SPI). Недавно появившийся в продаже модуль освещения L-SPI может работать с любым микроскопом, одномодовым волоконным лазерным источником света и научной камерой, что позволяет получать изображения плоскостного освещения больших, громоздких образцов.
По словам Лайсса, разработка прибора была сосредоточена вокруг комфорта для образцов и, как таковой, он имеет относительно «плотный» световой луч.
Рис. 3. Филипп Лайсс работает над прототипом микроскопа для микроскопии плоскостного освещения кораллов
Но, как утверждает исследователь, субмикронное разрешение изображения достижимо, когда для визуализации используются иммерсионные объективы, погруженные в воду. «Я видел детали, например, в эндосимбиотических водорослях в ткани коралла» - говорит он. «Я также вижу динамику самой структуры ткани, когда она прикрепляется и отсоединяется от скелета коралла». И, как подчеркивает Лайсс, сотрудничество с инженерами-проектировщиками из Cairn Research имело огромное значение для его разработки в области микроскопии плоскостного освещения. «Cairn Research отлично справился с миниатюризацией компонентов, сократив общие накладные расходы, и мы также работали с еще одной компанией по интеграции в прибор очень быстрых пьезоподвижек» - подчеркивает он. «Кроме того, наша самая большая камера для образцов имеет размеры шесть на шесть на два сантиметра, что просто огромно для микроскопии и идеально подходит для колоний кораллов».
Но это не все о кораллах. Лайсс провел лето в Океанографическом институте Вудс-Хоул, штат Массачусетс, США, исследуя, какие другие виды животных можно визуализировать с помощью модуля освещения L-SPI.
Рис. 4. Четырехсторонняя отраженная визуализация шмеля. Первый модуль L-SPI освещает сверху и справа, а второй снизу и слева. Шкала 1 мм. (Лайсс).
Как указывает Лайсс, головоногие моллюски в настоящее время являются предметом широкого исследования, включая редактирование РНК и неврологию, и, учитывая это, он и его коллеги получили изображение эмбриона кальмара в его скорлупе. «Весь эмбрион остался совершенно нетронутым, и для меня так важно, чтобы любой образец повреждался как можно меньше», - говорит он.
Лайсс и его коллеги также сделали снимки светочувствительных мшанок, водных беспозвоночных, и изучают растения арабидопсиса и никотании. «Растения очень интересны, но получить их изображения очень непросто, поскольку их трудно динамически визуализировать", - отмечает Лайсс.
Рис. 5. Отраженное изображение призрачной моли (Trioda sylvina) с короткими пластинчатыми усиками и отсутствующим хоботком (Лайсс)
Исследователь также с энтузиазмом относится к использованию этого устройства как части флуоресцентной гибридизации in situ для анализа речных отложений.
«Все это не касается фототоксичности, но мы можем сканировать большие области с этим модулем освещения намного быстрее, чем мы могли бы это сделать с помощью точечного сканирующего конфокального микроскопа» - говорит он. «В этом прелесть микроскопии плоскостного освещения - ее можно адаптировать различными способами».
Но на протяжении всего развития микроскопии плоскостного освещения снижение фототоксичности оставалось в центре внимания Лайсса. Как он говорит: «На самом базовом уровне я очарован взаимодействием света с живой материей и тем, что он может делать в контексте различных типов клеток». В самом деле, в рамках своих исследований кораллов на основе визуализации в реальном времени в Научно-исследовательском отделе коралловых рифов Университета Эссекса, в Школе биологических наук, Лайсс попытался свести к минимуму вызванное светом повреждение образцов во время наблюдений. В июле прошлого года он опубликовал статью «Оценка фототоксичности в живой флуоресцентной визуализации» в журнале Nature Methods.
Как подчеркивает Лайсс, многие обычные флуоресцентные микроскопы используют освещение на уровнях, повреждающих клетки, что приводит к противоречивым и даже вводящим в заблуждение результатам. Таким образом, для решения этой проблемы в его статье освещается проблема фототоксичности в биологии и даются рекомендации по оценке фотоповреждений. Важно отметить, что для исследователей подобные публикации повышают осведомленность биологов о том, что свет не безвреден, вызывает фотоповреждение любой наблюдаемой клетки и является серьезным препятствием для получения изображений в реальном времени и многих традиционных методов микроскопии.
«Научные журналы уделяют больше редакционного пространства опасностям фототоксичности, и рецензенты все чаще требуют контроля, чтобы гарантировать, что описанное поведение не является главным образом фотоиндуцированным», - отмечает он.
Рис. 6. Система освещения L-SPI от Cairn Research предназначена для работы с любым микроскопом, одномодовым оптоволоконным лазерным источником света и научной камерой
Учитывая растущую осведомленность о фототоксичности, Лайсс теперь надеется, что его осветитель L-SPI и микроскопия с использованием плоскостного освещения в целом будут все чаще использоваться для получения изображения биологических образцов. «Я думаю, что микроскопии плоскостного освещения еще предстоит пройти долгий путь, прежде чем она станет широко распространенной, но я думаю, что она добьется этого» - говорит он. «Я уверен, что через двадцать лет Вы найдете микроскопы с плоскостным освещением во многих лабораториях, где Вы изначально нашли бы конфокальные инструменты».
А тем временем Лайсс намерен продолжить изучение кораллов с помощью модуля освещения L-SPI. Как он утверждает, метод позволил ему изучать организмы при непрерывном освещении в течение двенадцати часов без стресса для образцов. «Я нахожу эти кораллы бесконечно интересными и теперь могу смотреть на них так, как никогда раньше» - говорит он. «И если это также поможет повысить осведомленность о наших коралловых рифах, находящихся под угрозой исчезновения, то тем лучше».
