Арт. SDR SensorDish® Reader
Гипоксия буквально означает «недостаток кислорода» и характеризует дефицит кислорода в клетках и тканях организма. В 2019 году Нобелевская премия по физиологии и медицине была присуждена трём исследователям гипоксии — Уильяму Кэлину-младшему (США), сэру Питеру Рэтклиффу (Великобритания) и Греггу Семенце (США). Они раскрыли молекулярные механизмы, с помощью которых клетки определяют уровень кислорода и адаптируются к его доступности — одного из важнейших процессов в живых системах. Благодаря этим пионерским исследованиям существенно расширилось понимание того, как различные уровни оксигенации регулируют фундаментальные физиологические процессы.
Клетки тем или иным образом «измеряют» уровень кислорода и способны адаптироваться под условиях окружающей среды. Для поддержания нормальных клеточных функций содержание кислорода должно находиться в относительно узком физиологическом диапазоне, индивидуально характерном для каждого типа ткани — так называемом физиоксическом диапазоне (physoxic range). In vivo в организме человека концентрация кислорода существенно варьирует между различными тканями, при этом её значения всегда значительно ниже атмосферного уровня (рис. 1). Физиологические значения, существенно меньшие по сравнению с атмосферной концентрацией кислорода, обычно обозначают как гипоксию (hypoxia, т.е. недостаток или дефицит кислорода), хотя фактически они соответствуют нормоксии in situ.
Рис. 1. Насыщение кислородом в различных типах тканей по данным Carreau A., El Hafny-Rahbi B., Matejuk A., Grillon C., Kieda C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 2011 Jun;15(6):1239–1253. Обзор.
Естественная адаптация к сниженным (гипоксическим) концентрациям кислорода в значительной степени опосредована транскрипционной активацией генов, обеспечивающих краткосрочные (например, транспорт глюкозы) и долгосрочные (например, ангиогенез) механизмы адаптации. Это позволяет поддерживать баланс между потребностью в кислороде и его доставкой. Ключевым регулятором клеточного ответа является транскрипционный фактор HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1, фактор, индуцируемый гипоксией), который активирует широкий спектр генов, контролирующих, в частности, энергетический метаболизм, рост кровеносных сосудов и синтез кислород-транспортирующих эритроцитов.
В большинстве лабораторных моделей клеточных культур экспериментальные значения кислорода соответствуют условиям стандартных CO₂-инкубаторов (без специальной регуляции концентрации O₂). В увлажняемых инкубаторах для культивирования клеток, поддерживаемых при стандартных 5 % CO₂, помимо атмосферных газов, испаряющаяся вода формирует дополнительное парциальное давление водяного пара (pH₂O) порядка 50 мбар (при 37 °C и 1013 мбар). В этих условиях содержание кислорода составляет около 18,6 % об. (v/v), что соответствует парциальному давлению кислорода (pO₂) 141 мм рт. ст. (Wenger et al., Hypoxia (Auckl). 2015 Sep 18; 3:35–43). В действительности ни одна клетка в организме не подвергается столь высокой концентрации кислорода.
Многочисленные эксперименты показали, что клетки, культивируемые в условиях пониженного содержания кислорода (гипоксии), могут расти быстрее, дольше сохранять жизнеспособность и испытывать меньший стресс. Поэтому в лабораторных исследованиях крайне важно оптимизировать условия культивирования, используя кислородную среду, максимально приближенную к условиям in vivo.
Несмотря на хорошо известную роль гипоксии в биологических процессах, для большинства исследователей точный контроль и мониторинг гипоксических условий остаются сложной задачей, поскольку лишь высокотехнологичное оборудование позволяет точно регулировать температуру, влажность и состав газовой среды (CO₂ и O₂) в инкубаторе.
Методы
В настоящее время существует несколько подходов к созданию гипоксических условий для культивируемых клеток. Один из них основан на использовании модульных герметичных газовых камер в стандартном CO₂-инкубаторе. Такие камеры размещаются внутри инкубатора и позволяют снижать концентрацию кислорода in vitro, обеспечивая длительное культивирование клеток в условиях гипоксии.
Другой широко применяемый метод — культивирование в так называемых «трёхгазовых» (tri-gas) инкубаторах, хотя данное название не совсем корректно. Фактически добавляются только два газа — углекислый газ (как обычно) и азот, который используется для снижения содержания кислорода.
Однако в обоих случаях возникают трудности с визуализацией гипоксии в реальном времени или клеточных процессов в ответ на гипоксические условия, если требуется последующий анализ, например, с использованием микроскопии. Это связано с тем, что клетки необходимо извлекать из инкубатора. При открытии инкубатора происходит поступление кислорода из окружающего воздуха, что может приводить к искажению результатов, поскольку концентрация кислорода быстро возрастает (рис. 2). Кроме того, часто недооценивается время, необходимое для выравнивания содержания кислорода в культуральной среде, изначально насыщенной атмосферным воздухом, с газовой средой инкубатора.
Дополнительно следует отметить, что ряд стандартных маркеров гипоксии, таких как пимонидазол или EF5, требуют фиксации клеток, то есть их гибели, с последующим иммунным окрашиванием. Даже при использовании флуоресцентных красителей, применимых для живых клеток, сохраняется проблема влияния атмосферного кислорода. Именно поэтому всё более распространённым становится прямое измерение фактической концентрации кислорода непосредственно в культуральном сосуде с использованием специализированных измерительных систем.
Рис. 2. Изменение насыщения кислородом в планшетах для клеточных культур (OxoDish®) в инкубаторе с заданным содержанием O₂ 2 %, измеренное с помощью 24-канального считывателя SDR SensorDish® Reader: требуется более 9 часов для достижения пониженного уровня O₂ в образце, соответствующего атмосфере инкубатора. При открытии инкубатора (небольшие пики) или извлечении планшета из инкубатора с закрытой крышкой (крупные пики) содержание O₂ увеличивается.
Системы мониторинга кислорода
Ассортимент оборудования PreSens включает различные химико-оптические сенсорные системы, позволяющие определять текущий уровень гипоксии в клеточной культуре без потребления кислорода, неинвазивно и без извлечения культуральных сосудов из инкубатора.
Для культивирования клеток в многолуночных планшетах PreSens предлагает систему SensorDish® Reader для определения текущего уровня гипоксии. SensorDish® Reader представляет собой компактный 24-канальный считыватель для регистрации кислорода или pH в многолуночных планшетах (SensorDishes®). В каждой лунке таких планшетов на дне расположен сенсорный элемент (sensor spot), считываемый неинвазивно через прозрачное дно. Планшеты SensorDishes® для измерения кислорода (OxoDish®) и pH (HydroDish®) доступны в форматах на 24 и 6 лунок. Кислородные сенсоры, расположенные на дне OxoDish®, измеряют содержание кислорода в среде непосредственно вблизи сенсорного элемента. Они могут использоваться при концентрации кислорода в атмосфере инкубатора от 1 % O₂.
SDR SensorDish® Reader с планшетами OxoDish®
Неинвазивный измерительный принцип PreSens VisiSens™ обеспечивает возможность визуализации параметров в статических (без перемешивания) клеточных культурах в многоячеечных планшетах и культуральных флаконах (T-flasks). Метод сочетает флуоресцентные сенсорные плёнки для измерения кислорода, pH или CO₂ с технологией двумерного считывания (2D), что позволяет визуализировать распределение соответствующего параметра в клеточной культуре. Биосовместимые сенсорные плёнки могут быть интегрированы в различные прозрачные культуральные сосуды. Клетки культивируются непосредственно на поверхности сенсорных плёнок, благодаря чему измерения проводятся непосредственно в перицеллюлярной микросреде.
Система VisiSens™ DU01
Как SensorDish® Reader, так и детекторный модуль VisiSens™ могут быть установлены непосредственно внутри инкубатора для обеспечения стабильных условий культивирования (температура, концентрации O₂ и CO₂). Это позволяет в реальном времени контролировать процессы в клеточных культурах при содержании кислорода в атмосфере инкубатора от 1 % O₂ и выше.
