Суспензионные культуры бактерий и клеток млекопитающих широко применяются в биотехнологии для получения различных соединений, а также в фундаментальных исследованиях в качестве модельных систем. Особенно важную роль жидкие культуры играют в медицинской науке, где они помогают изучать механизмы заболеваний и разрабатывать новые методы лечения.
В этой статье рассмотрим преимущества и ограничения суспензионного культивирования, объясним, почему необходимо непрерывно контролировать состояние культуры, какие методы мониторинга существуют и какие решения для этой задачи предлагает PreSens.
Культивирование в суспензионных культурах
Для многих задач выращивание клеток и микроорганизмов осуществляется в жидких средах. Такой подход используется как для накопления определенного вида микроорганизмов, так и для получения большого количества клеточной биомассы.
Сегодня существует широкий выбор сосудов для культивирования суспензионных культур:
- колбы Эрленмейера;
- спиннерные колбы;
- колбы с перегородками (baffled flasks);
- роллерные бутылки;
- многолуночные планшеты.
При проведении скрининговых исследований и оптимизации биотехнологических процессов в лабораторном масштабе аэробные микроорганизмы и клетки чаще всего выращивают именно в колбах-шейкерах. Это простой, экономичный и удобный способ одновременно проводить большое количество параллельных экспериментов.
Перемешивание обеспечивает ряд преимуществ:
- предотвращает осаждение клеток;
- препятствует образованию биопленок;
- снижает вероятность образования клеточных агрегатов;
- способствует равномерному распределению питательных веществ по всему объему среды.
Однако использование конических колб имеет и существенный недостаток. В процессе культивирования условия внутри колбы постоянно изменяются: снижается концентрация питательных веществ, уменьшается содержание кислорода, накапливаются продукты метаболизма, изменяется pH среды.
Такие явления, как кислородное голодание, переполнение метаболических путей (overflow metabolism) или изменение кислотности, часто остаются незамеченными при работе с небольшими объемами. В результате параметры процесса, успешно работающие в лабораторном масштабе, могут оказаться непригодными при последующем масштабировании производства.
Именно поэтому непрерывный мониторинг состояния культуры является важнейшей частью современных биотехнологических исследований.
Мониторинг культуры в режиме реального времени
Компания PreSens предлагает системы SFR vario и SFR Shake Flask Reader — неинвазивные измерительные комплексы на основе оптических химических сенсоров, предназначенные для непрерывного контроля параметров культивирования в колбах-шейкерах.
Системы позволяют в режиме реального времени измерять: концентрацию кислорода (O₂) и значение pH. Дополнительно автоматически регистрируются: температура и скорость перемешивания (rpm), что облегчает последующий анализ процесса и сопоставление результатов различных экспериментов.
Рисунок 1. Пример применения оптических датчиков кислорода при культивировании Corynebacterium glutamicum ATCC 13287 в четырехсекционных колбах-шейкерах с перегородками объемом 250 мл, оснащенных оптическими сенсорами, при скорости перемешивания 100 и 150 об/мин соответственно. Адаптировано по: Wittmann et al. Characterization and application of an optical sensor for quantification of dissolved O₂ in shake-flasks. Biotechnology Letters. 2003;25(5):377–380.
На рисунке 2 показан пример культивирования Escherichia coli K12 в колбе Эрленмейера при температуре 37 °C на синтетической питательной среде. Во время всего процесса системы SFR vario непрерывно контролировали концентрацию кислорода и уровень pH.
Рисунок 2
Как избежать кислородного голодания культуры
Если во время культивирования наблюдается недостаток кислорода, необходимо увеличить эффективность его поступления в жидкую среду.
Поскольку перенос кислорода происходит через поверхность жидкости, скорость его поступления напрямую зависит от интенсивности перемешивания и площади контакта среды с воздухом. При встряхивании на поверхности образуются мелкие пузырьки воздуха, что существенно улучшает газообмен.
Для увеличения поступления кислорода рекомендуется:
- повысить скорость перемешивания;
- подобрать оптимальное соотношение объема среды и объема колбы;
- использовать колбы с перегородками (baffled flasks).
- Все эти меры позволяют значительно повысить эффективность аэрации культуры.
На рисунке 3 представлены результаты непрерывного измерения концентрации кислорода в двух параллельных культурах E. coli DH5α, выращиваемых в комплексной среде LB.
Постоянный контроль уровня кислорода позволяет своевременно изменять скорость перемешивания и предотвращать возникновение кислородного дефицита. Кроме того, система сразу показывает, привела ли предпринятая корректировка к ожидаемому результату.
Рисунок 3
Многоканальные системы для мониторинга культур в колбах-шейкерах
Для контроля параметров культивирования в колбах компания PreSens предлагает два решения.
SFR vario
Система одновременно измеряет:
- кислород (O₂);
- pH;
- биомассу;
- содержание CO₂ (опционально).
Программное обеспечение позволяет одновременно управлять четырьмя устройствами SFR vario, что обеспечивает параллельный мониторинг четырех колб.
SFR Shake Flask Reader
Система предназначена для измерения:
- концентрации кислорода;
- pH
- одновременно в девяти колбах.
До семи устройств SFR Shake Flask Reader могут быть объединены в единую систему, что позволяет одновременно контролировать до 63 колб.
Обе системы автоматически рассчитывают показатель OUR (Oxygen Uptake Rate, скорость потребления кислорода) и подходят для мониторинга в различных типах сосудов:
- колбах Эрленмейера;
- культуральных пробирках;
- T-флаконах для культивирования клеток.
Благодаря непрерывному контролю ключевых параметров среды системы PreSens помогают своевременно выявлять изменения в процессе культивирования, оптимизировать условия роста микроорганизмов и клеток, а также существенно повысить воспроизводимость результатов и успешность масштабирования биотехнологических процессов.
