Органоиды отображают особенности и структуры органов путем создания трехмерной культуры клеток. Универсальность органоидов делает их важной моделью в биомедицинских исследованиях, помогая сократить использование животных модельных систем и сосредоточиться на патологиях конкретных пациентов. Конфокальная технология NL5+ Line REscan разработана для быстрой, глубокой и фотонетоксичной визуализации живых клеток, что делает ее идеальным инструментом для визуализации органоидов.
Недавние достижения в области органоидной технологии произвели революцию в биомедицинских и фармацевтических исследованиях in vitro. 3D-модели органоидов преодолевают ограничения традиционных монослойных клеточных культур, обеспечивая более высокую клеточную гетерогенность, структуру и функциональные характеристики, аналогичные первичным тканям. Органоиды представляют собой сложные структуры, развивающиеся из стволовых или прогениторных клеток, а также из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, с целью имитации архитектуры и функций различных тканей, таких как органы, кожа и другие [Simian, M. & Bissell, M. J., 2017]. Для исследования 3D-конформаций клеток и их функциональных особенностей внутри органоидов часто используется флуоресцентная микроскопия. Однако визуализация органоидов требует сложной и длительной подготовки образцов, а также значительных затрат, так как высокая интенсивность света, необходимая для исследования всей структуры органоида, может изменить физиологию клеток, а сигнал с глубоких слоев часто теряется, что затрудняет изучение живых клеток. В этой статье представлена конфокальная система NL5+ Line REscan, оптимизированная для работы с толстыми живыми образцами, которая предлагает решение этих проблем и значительно улучшает визуализацию органоидов.
Объемная визуализация кишечного органоида с помощью NL5+
Было получено изображение целого органоида глубиной 280 мкм (рис. 1А). После деконволюции было достигнуто разрешение 170 нм (рис. 1В), без потери сигнала вдоль 3D-структуры. Был получен Z-стек из 140 изображений с шагом 2 мкм.
Рисунок 1. Органоид кишечника. А) Максимальная 3D-проекция Z-стека B) Центральный срез органоида. Окрашивание: 488 - KI67 (синий); 561 - H2B-mCherry (зеленый); 640 - E-кадхерин (красный). Изображения получены с помощью конфокальной системы NL5+ со щелью 20 мкм, объектив UPLSAPO30XSIR (A) и UPLSAPO60xS2 (B).
3D-таймлапс опухолевого органоида кишечника мыши
Была проведена визуализация живых клеток для наблюдения за развитием органоида с помощью 3D-таймлапса (рис. 2). Z-стеки получали каждые 3 мин в течение 24 часов с шагом 1 мкм для полного объема 30 мкм. После полной съемки не наблюдалось видимой фототоксичности или фотообесцвечивания образца.
Рисунок 2. Органоид опухоли кишечника мыши. Цветовой код, обозначающий глубину клетки, максимальная проекция, для Z-стека в 2 часа. Окрашивание: 561 - H2B-mCherry. Изображения получены с помощью конфокальной системы NL5 с щелью 50 мкм, объектив UPLXAPO40XO
Многоцветное 3D изображение целого эмбриона мыши
Z-стеки изображений из 282 срезов были получены с шагом 0.5 мкм. Качество каждого канала было одинаковым на протяжении всего стека (рис. 2А). Был получен объем всего эмбриона (140 мкм) (рис. 2В).
Рисунок 3. Эмбрион мыши на стадии E5.5, культивируемый в течение 24 часов in vitro. А) Центральный срез в XY, YZ и XZ проекциях стека Б) Максимальная 3D-проекция полного Z-стека. Окрашивание: 405 - DAPI (синий); 488 - фаллоидин (зеленый); 647 - pHH3 (пурпурный). Изображения получены с помощью конфокальной системы NL5+ с щелью 20 мкм, объектив UPLSAPO30XSIR
Заключение
NL5+ Line REscan - это модуль для микроскопии на основе запатентованной технологии конфокального сканирования [Sheppard, C. J. R. & Mao, 1988;. De Luca, G. M. R. et al. 2013], предназначенный для быстрого получения изображений при работе с низкой мощностью лазера. Возможности используемой технологии делают модуль идеальным инструментом для визуализации живых клеток в 3D, таким образом он отлично подходит для толстых образцов. В данной статье показано, что с помощью NL5+ можно получать многоцветные 3D-изображения органоидов глубиной до 280 мкм без видимой потери сигнала. В принципе, можно получать изображения даже образцов размером до 1000 мкм, единственным ограничением является рабочее расстояние объектива. Было получено разрешение 240 нм на необработанных изображениях и 170 нм после деконволюции для возбуждения с длиной волны 488 нм. Кроме того, было продемонстрировано, что можно проводить длительную съемку таймлапс живых клеток в 3D-органоиде опухоли мыши. Были получены Z-стек изображения каждые 3 мин в течение 24 часов, не вызывая фототоксичности или фотообесцвечивания образца.
Обзор конфокальной системы NL5+ Line REscan
NL5+ Line REscan - это универсальная дополнительная конфокальная система, которая может быть объединена с различными комбинаторами лазеров, большинством камер sCMOS и практически любым широкопольным микроскопом для создания передовой системы конфокальной визуализации с быстрым сканированием.
Особенности:
- Скорость до 75 кадров в секунду
- Совместимость с вертикальным и инвертированным микроскопом
- 6 позиций колеса эмиссионных фильтров
Рисунок 4. Конфокальная установка NL5+. A) Блок NL5+ Б) Блок NL5+, установленный на инвертированном микроскопе
