Введение
Задача визуализации живых образцов в флуоресцентной микроскопии заключается в получения сложных трехмерных изображений с высоким временным и пространственным разрешением при минимальном механическом воздействии на исследуемый образец. Дистанционная фокусировка — это метод, который позволяет быстро перефокусировать изображение без перемещения образца или объектива.
Рис. 1 Система с дистанционной фокусировкой для конфокальной микроскопии Aurox Clarity
Авторы статьи представляют оптическую схему, построенную с использованием модуля Aurox Clarity (рис. 1) для конфокальной микроскопии без лазерного излучения. Данная система предназначена для быстрого оптического секционирования образца в сочетании с системой дистанционной фокусировки для быстрого получения изображений живых образцов с клеточным разрешением. Упрощенная оптическая схема, воспроизведенная из публикации, показана на рис. 2.
Рисунок 2. Упрощенная оптическая схема работы модуля Clarity и системы дистанционной фокусировки
При небольшом компромиссе относительно качества осевого разрешения конфокальные микроскопы на основе вращающегося диска могут получать оптические срезы с более высокой скоростью, чем традиционные лазерные сканирующие системы. Традиционно конфокальные микроскопы на основе вращающегося диска используют лазеры для освещения образца, что делает их дорогими, громоздкими и негибкими. Использование компактного конфокального модуля Clarity на основе вращающегося диска и светодиодного источника в сочетании с системой дистанционной фокусировки минимизирует сложность конструкции, сохраняя при этом гибкость конфигурации и производительность системы для решения большинства задач визуализации.
Эксперимент
Структурированный свет, полученный прохождением через вращающийся диск (SD) модуля Clarity передается через дистанционный фокусирующий блок на образец. Сигнал флуорисцирующего образца собирается с помощью объектива O1 (40X 0.8 NA, вода), а полученное увеличенное изображение уменьшается с помощью перефокусирующей линзы O2 (40x 0.95 NA воздух). Третий объектив O3 (идентичный O2) передает изображение плоскости образца обратно на вращающийся диск. Возбужденный флуоресцентный сигнал от областей, находящихся в фокусе, проходит на одну половину детектора sCMOS камеры (CAM) через верхний путь, а флуоресцентный сигнал, полученный от областей вне фокуса, падает на вторую половину детектора камеры через нижний путь (рис.2). Обработка этих двух изображений позволяет получить конфокальное изображение образца. При сканировании и десканировании по оси Z положение O3 определяет осевое расположение интересующей нас плоскости в образце. FM=зеркало, DM2=дихроичное зеркало. Тубусные линзы L1 (f = 180 мм) и L2 (f=140 мм).
Визуализации кальция
Осевые и латеральные полуширины менее 5 мкм и 490 мм соответственно были продемонстрированы в осевом диапазоне 130 мкм с полем зрения 256×128 мкм. Для достижения выравнивания, минимизирующего искажение изображения, был использован калибровочный слайд.
Кроме того, высокое временное разрешение системы позволило визуализировать изменения электрической активности через связывание Ca2+ с GCaMP в области передней нервной системы Platynereis dumerilii. Частота дискретизации 1 Гц наблюдалась для всего визуализируемого объема толщиной 24 мкм с хорошим отношением сигнал/шум. Эта система также использовалась для записи многоканальных изображений фиксированных выборок, как показано на (рис. 3).
|
|  |
Рисунок 3. Многоканальные изображения фиксированных личинок Platynereis dumerilii в возрасте (a) 2 дня после оплодотворения, (b) 3 дня после оплодотворения. Красители: (a) голубой (DAPI) = ядер; красного (DsRed) = pERK, (b) красный = THDa, зеленый = ацетилированный тубулин. Масштаб: (а) 30 мкм (b) 50 мкм.
Выводы
Гибкость конфокальной приставки Clarity и новый плагин Micro-Manager от Aurox позволили создать уникальную оптическую схему для быстрого получения конфокальных изображений с дистанционной фокусировкой. Даже при визуализации с использованием модуля быстрого сканирования по оси Z, модуль Clarity обеспечил достаточное количество сигнала для точного секционирования исследуемого образца.
