Введение
Конфокальная микроскопия является важным инструментом в исследованиях микологии, создающая изображения исследуемых объектов без размытости с высоким пространственным разрешением и контранстом. Могут быть получены проекции, находящиеся полностью в фокусе объектива в живых клетках или неподвижных образцах, позволяя исследователю наблюдать особенности, которые были бы скрыты информацией от областей вне фокуса. Основное применение конфокальной микроскопии в микологических исследованиях - обнаружение и выявление грибов в клинических образцах и идентификация грибов на основе их морфологии. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия является полезным инструментом. Тем не менее, конфокальная микроскопия на основе вращающегося диска (спиннинг-диск микроскопия) предпочтительнее из-за меньшей фототоксичности и более слабого фотообесцвечивания. В работе описанной в данной статье применялся конфокальный оптический модуль Clarity без использования лазерного излучения от компании Aurox, работа которого основана на структурированном освещении, полученном с помощью вращающегося диска, для визуализации изображений микологических образцов.
Эксперимент
Эксперимент №1: Сравнение широкопольной и конфокальной визуализации
Образец плесени 1, Rhizopus Sporangia (хлебная плесень) и образец 2, Penicillium (пенициллиум), были окрашены гематоксилином Харриса и контрастно окрашены флоксином (Phloxine B). Для фиксации использовалась прозрачная, быстро сохнущая среда Eukitt. Для обоих образцов 1 и 2 были зарегистрированы z-стеки как в широкопольном, так и в конфокальном режиме, используя оптический модуль Clarity от Aurox и 10х-кратный объектив с числовой апертурой 0.45NA.
Для образца 1 параметры оптического канала были FITC: время экспозиции 40 мс, MCherry: время экспозиции 40 мс. Конфокальное разрешение по оси Z составило 14 мкм, а общий размер стека составил 196 мкм. Для образца 2 параметры оптического канала были FITC: время экспозиции 40 мс, MCherry: время экспозиции 60 мс. Конфокальное разрешение по оси Z составило 14 мкм и общий размер стека составил 168 мкм.
Эксперимент №2: Получение многоцветного изображения неподвижного медицинского микологического образца
Штамм Candida albicans SC5314, объединенный с макрофагами, полученными из костного мозга мыши, фиксированные 2% формальдегидом и окрашенные: Rhodamine Phalloidin для визуализации макрофагов Actin (синий); Calcofluor White для визуализации грибов Chitin (красный) и зонд Fc-Dectin-1, меченный FAb-Alexafluor488 для визуализации открытого грибкового β-глюкана (зеленый). Клетки выращивали и визуализировали на 8-луночных предметных стеклах Ibidi с PBS. Был записан 3-цветный конфокальный Z-стек для исследуемого образца с использованием объектива с 40-кратным увеличением и числовой апертурой 0.95NA. Оптические каналы были DAPI: время экспозиции 20 мс, GFP: время экспозиции 700 мс, DsRed: время экспозиции 120 мс. Конфокальное разрешение по оси Z составило 1.2 мкм, а общий размер стека составил 10 мкм.
Все конфокальные изображения были получены с использованием оптического модуля Clarity от Aurox и программного обеспечения Aurox Visionary. Оптический модуль Clarity был установлен на микроскоп Nikon Ti-E. В качестве источника света использовался светодиодный осветитель CoolLED pE300 Ultra и детектором была sCMOS камера Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3.
Данные изображения одним нажатием компьютерной мыши автоматически экспортировались в программное обеспечение ImageJ/Fiji с помощью функции экспорта Aurox Visionary. Изображения с максимальной проекцией были созданы с использованием ImageJ/Fiji.
Результаты
Конфокальные изображения без использования лазера (рис. 1: Rhizopus и рис. 2: Penicillium), полученные из эксперимента №1, демонстрируют значительно более высокое разрешение и четкость картинки по сравнению с широкопольными изображениями (рис. 3: Rhizopus и рис. 4: Penicillium), которые были получены при тех же установленных параметрах сбора данных.
Рис. 1 и 3. Конфокальное (справа) и широкопольное (слева) изображения Rhizopus Sporangia
Рис. 2 и 4. Конфокальное (справа) и широкопольное (слева) изображения Pencillium
Эксперимент №2 позволил получить ясные и четкие трехцветные конфокальные изображения образца (рисунок 5). Эти изображения позволили легко идентифицировать виды, присутствующие в образце и их взаимодействие. Тот же метод сбора данных может быть легко воспроизведен с использованием живого образца.
Рис. 5 Конфокальное 3-х цветное изображение Candida и макрофагов
Выводы
Конфокальный оптический модуль без использования лазерного излучения Clarity от компании Aurox - отличный инструмент для записи высококачественных 5D (x,y,z,t,λ) конфокальных изображений для исследования микологических образцов, обеспечивающий отличное оптическое секционирование простым в использовании и доступным способом.
