Введение
Визуализация живых клеток в течение продолжительного времени является сложной задачей. Основной проблемой для биолога, занимающегося микроскопией, является фототоксичность. Свет, необходимый для возбуждения флуоресцентных молекул, которыми маркируют образец, также вызывает фотообесцвечивание и фототоксичность [1]. Фототоксичность представляет собой комплекс сложных процессов, в которых возбужденный флуорофор реагирует с кислородом, что приводит к образованию активных форм кислорода и свободных радикалов, которые, в свою очередь, реагируют с ДНК, РНК, белками, липидами, приводящими к повреждению клеток, задержке клеточного цикла и гибели клеток. Во избежание фототоксичности общая доза освещения на образце должна быть сведена к минимуму. Как правило, это достигается путем уменьшения (1) мощности лазера, (2) времени экспозиции изображения, (3) количеством пикселей в кадре, (4) количеством кадров в Z-стеке и (5) частотой дискретизации (количество изображений в единицу времени). Снижение дозы света за счет снижения мощности лазера (1) и времени экспозиции (2) приводит к снижению отношения сигнал/шум из-за стохастической природы света. Другие методы снижения фототоксичности (3)-(5) приведут к потере пространственного и временного разрешения, что приведет к меньшей видимости мелких деталей и динамического поведения молекул в клетках. Одним из самых простых решений этой проблемы является повышение эффективности обнаружения системы визуализации для микроскопии.
Митохондрии являются органеллами, содержащимися в эукариотических клетках, и играют жизненно важную роль в выживании клеток. Ключевой функцией митохондрий является производство энергии путем преобразования кислорода и питательных веществ в аденозинтрифосфат (АТФ) хорошо контролируемым образом [2]. Дисфункция митохондрий связана со все большим количеством наследственных нарушений здоровья человека, которые могут поражать любой орган и проявляться в любом возрасте [3]. Морфология митохондрий сильно варьируется: от сферических до удлиненных разветвленных структур, в зависимости от типа клеток и физиологического состояния клеток. Визуализация живых клеток имеет решающее значение для понимания взаимосвязи между изменением морфологии митохондрий и функцией митохондрий [4]. Принимая во внимание также, что диаметр митохондрий обычно составляет от 250 до 500 нм [5], динамику митохондрий лучше всего отслеживать с помощью флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Митохондрии сложны для изображения органелл, поскольку их функция и морфология сильно зависят от фототоксичности.
В данной статье приведены результаты эксперимента долговременной визуализации (в течение 44 часов) митохондриального матрикса в клетках HO1N1 с использованием ре-сканирующего конфокального микроскопа (RCM) от компании Confocal.nl. Показано, что, выбирая подходящее оборудование и маркировку флуоресцентными красителями, можно выполнять высокочастотную визуализацию митохондрий в живых клетках и оценивать их морфологию и динамику посредством нескольких клеточных делений.
Визуализация митохондрий живых клеток в течении более 24 часов. 8500 кадров. Данные доказывают, что фотоповреждения не происходит.
Оптический RCM модуль для конфокальной микроскопии использовался в данном эксперименте благодаря его чувствительности - его детектор на основе камеры имеет очень высокую квантовую эффективность (95%), что позволяет значительно снизить мощность используемого лазера. Даже при сниженной мощности лазера изображения имеют высокую контрастность и высокое отношение сигнал/шум. В то же время повторное сканирование исследуемого образца создает изображения со сверхвысоким разрешением, обеспечивающие хорошую детализацию морфологии митохондрий.
Митохондрии окрашивали с использованием набора для флуоресцентной окраски клеток Bacmam 2.0 (Invitrogen). Клетки, трансфицированные данным красителем, экспрессируют митохондрии, меченные RFP-слитым белком. Было показано, что краситель Bacmam 2.0 сохраняет экспрессию рекомбинантного белка в течение нескольких недель, прежде чем теряет вирусный вектор из-за диссегрегации. В этом методе окрашивания копии генома вируса трансфицируются в клетки. Промотор млекопитающих используется для управления транскрипцией, что означает, что, пока копия вирусного генома присутствует в клетке, создаются новые флуоресцентные слитые белки. Во время визуализации в среду добавляли антифадный реагент Prolong Live (LIFE TECHNOLOGIES).
Полученные данные
Был визуализирован митохондриальный матрикс в клетках HO1N1 в течение продолжительного времени (в течение 44 часов) с частотой один кадр каждые десять секунд, что в сумме составляет 16 000 кадров. В течение 44 часов клетки в поле зрения объектива микроскопа делятся и перемещаются в/из поля зрения. То, что происходит в эти моменты времени, проиллюстрировано в компиляции изображений на рисунке 1. Эта компиляция показывает каждый 600-й фрагмент (1 фрагмент в час) из полученного видеоряда, подходящий для визуализации макро-событий, происходящих в течение 44-часового периода. На протяжении всего видеоряда можно заметить деление клеток, указывающее на то, что условия визуализации достаточно мягкие, чтобы предотвратить накопление повреждений. Избыточное повреждение лазерным излучением может помешать клеткам делиться и привести к гибели клеток.
Рисунок 1. Выборка изображений в течение 44 часов визуализации живых клеток.
Затем, чтобы подтвердить, что наши условия визуализации достаточно мягкие и позволяют получать конфокальное изображение в течение долгого времени, даже в течение более длительных периодов, чем текущие 44 часа, было проанализировано, как интенсивность флуоресценции изменяется во времени, рисунок 2. По мере деления клеток и флуоресцирующих молекул между дочерними клетками не делали акцент на отслеживании отдельных клеток во времени, но анализировали изменение общей средней интенсивности флуоресценции в каждом кадре в течение записанного видеоряда. Такой подход указывает на потерю общей флуоресценции в течение нескольких кадров изображений, что означает фотообесцвечивание исследуемого образца.
Рисунок 2. Средняя интенсивность флуоресценции, интенсивность первого кадра изображения была установлена на значение 1.
Основываясь на профиле интенсивности, можно определить два различных уровня суб-поведения. Они хорошо соответствуют событиям, происходящим во время записи изображений.
1. Первоначально средняя общая интенсивность флуоресценции остается постоянной с острыми пиками низкой интенсивности, появляющимися до деления клеток (кадры 1-15 из компиляции изображений) - соответствующие кадрам 1 и 9000.
2. Одновременно с потерей интенсивности флуоресценции кадра клетка с высокой интенсивностью флуоресценции выходит за пределы поля зрения объектива (кадры 16-25), что соответствует кадрам 9000 и 16000.
Чтобы лучше решить вопрос с фотообесцвечиванием, в дальнейшем анализе использовали область интереса ROI, которая не содержит слева на изображении клетку с высокой интенсивностью флуоресценции, рисунок 3.
Рисунок 3. Область интереса (ROI), используемая в дальнейшем анализе, обозначена желтой рамкой.
В течение этого 44-часового периода времени мы видим менее чем 20% потерю средней интенсивности флуоресценции, рисунок 4а. Отношение сигнал/шум действительно уменьшается из-за разбавления сигнала между дочерними клетками. Низкие впадины в профиле вызваны тем, что клетки выходят из фокуса объектива до деления клетки, рисунок 4б.
Рисунок 4а. Средняя интенсивность флуоресценции с использованием области интереса ROI, определенных на рисунке 3, интенсивность первого кадра была установлена на значение 1.
Рисунок 4б. Внезапные провалы средней интенсивности флуоресценции указывают на моменты времени деления клеток.
Затем объектив был настроен на деление клеток, искали последующие деления клеток. Была проанализирована флуоресценция материнской клетки и ее потомства по отдельности и в группе, рисунки 5a и 5б.
Рисунок 5а. Начальная флуоресценция материнской клетки равномерно распределяется по дочерним клеткам.
Рисунок 5б. При делении дочерних клеток, опять же, флуоресценция делится поровну между своими дочерними клетками.
Как видно, при делении клетки начальная флуоресценция материнской клетки равномерно распределяется по дочерним клеткам. И после деления дочерних клеток, опять же, флуоресценция делится поровну между своими дочерними клетками.
Выводы
В целом эти данные показывают, что, хотя молекулы флуоресцентного красителя делятся между дочерними клетками, общая средняя интенсивность флуоресценции не уменьшается. Это говорит о том, что условия визуализации достаточно мягкие, а используемая мощность лазера достаточно мала, чтобы не вызывать обесцвечивание образца и не вызывать фототоксичность при длительной визуализации.
На общую среднюю интенсивность флуоресценции не оказывается даже минимальное влияние во время визуализации. Однако, когда анализируются отдельные клетки, мы видим потерю интенсивности флуоресценции, сопутствующую клеточному делению. Начальная флуоресценция делящейся клетки делится между ее дочерними клетками.
Даже после ряда последовательных делений клеток (разбавление красителя в дочерних клетках) мы все еще можем визуализировать митохондрии с высоким отношением сигнал/шум после 44 часов и 16 000 кадров.
Обзор оптического RCM модуля для конфокальной микроскопии
Оптический RCM модуль для конфокальной микроскопии (конфокальный ре-сканирующий микроскоп) имеет улучшенное обнаружение по трем причинам.
1) RCM - это конфокальная технология на основе камеры. В RCM в качестве детектора света системы используется sCMOS или EMCCD камера. Квантовая эффективность этих камер очень высока (до 95%) по сравнению с детекторами, используемыми в классической конфокальной микроскопии (фотоэлектронные умножители (ФЭУ): 10-20%, GaAsP и гибридные детекторы: около 40%).
2) «Концентрация» света. Поскольку RCM - это метод получения сверхразрешения, изображение объекта с меньшим разрешением будет проецироваться на камеру меньше по сравнению с обычной флуоресцентной микроскопией. Поскольку разрешение в 2 раза выше, свет будет концентрироваться на поверхности, которая в 2 раза меньше, и, следовательно, каждый пиксель изображения объекта будет обнаруживать в 2 раза больше фотонов.
3) RCM позволяет увеличить точечное отверстие для прохождения света (пин-холл). В классической конфокальной микроскопии единственным способом улучшить латеральное (боковое) разрешение является уменьшение размера точечного отверстия до значения менее 1 AU (Airy Unit). В RCM латеральное разрешение всегда в 2 раза лучше, чем разрешение Аббе, и не зависит от размера точечного отверстия. Таким образом, в RCM допускается более крупное отверстие без потери латерального разрешения, и поэтому конфокальная система имеет более высокую эффективность обнаружения. Обратите внимание, что размер отверстия также влияет на возможность секционирования и поэтому ограничен. По этим трем причинам система детектирования RCM более чувствительна, чем в классический конфокальный микроскоп и, следовательно, интенсивность лазера может быть значительно снижена, что приведет к меньшей фототоксичности исследуемого образца. Для изучения биологических образцов это означает, что можно визуализировать больше деталей при более высокой частоте отбора проб и меньшем фотоповреждении клеток.
Использованные методы
Приготовление образца: Окрашивание митохондрий в клетках HO1N1 с помощью Mitochondria RFP во флуоресцентном наборе для окрашивания клеток Bacmam 2.0 ((Invitrogen C10601) проводили в соответствии с протоколом производителя. Добавляли антифадный реагент Prolong Live (LIFE TECHNOLOGIES P36975) в среду для культивирования клеток разведением в соотношении 1:100. Клетки выращивали и визуализировали в 8-луночном планшете IBIDI со стеклянным дном.
Система визуализации: Замедленные эксперименты проводились с помощью оптического модуля для ре-сканирующей конфокальной микроскопии RCM (RCM 1.1 VIS), оснащенного микроскопом Nikon Ti2, камерой Hamamatsu Orca Flash 4.0 V3 и лазером Omicron 561 нм 20 мВт. Инкубатор Okolab использовался для поддержания клеток в оптимальном живом состоянии во время процесса визуализации.
Промежуточное изображение митохондрий: Изображения размером 2048x2048 пикселей получали каждые 10 секунд в течение 61 часа с использованием объектива Nikon CFI Plan Fluor 40x oil 1.3 NA. Мощность лазера на плоскости образца составляла 1 мкВт. Осевой дрейф предметного столика микроскопа был исправлен с помощью PFS (Perfect Focus System).
Используемая литература:
[1] Breedijk RMP, Wen J, Krishnaswami V, Bernas T, Manders EMM, Setlow P, Vischer NOE, Brul S.Sci Rep. 2020 Mar 24;10(1):5312. doi: 10.1038/s41598-020-62377-1
[2] Osellame L.D, Blacker T. S, Duchen M. R. Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2012 Dec; 26(6): 711–723.
[3] Nunnari J, Suomalainen A.Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 2012 Mar 16;148(6):1145-59.
[4] Mitra K, Lippincott-Schwartz J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. 2010 Mar; Chapter 4: Unit 4.25.1-21.
[5] Jakobs S, Wurm CA. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 2014 Jun; 20:9-15.
