Со времени новаторских исследований команды Синъи Яманаки в области репрограммирования клеток с помощью транскрипционных факторов, отмеченных Нобелевской премией, технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) получили значительное развитие. Появление неинтегративных методов репрограммирования и химической индукции позволило получать iPSC без введения экзогенных генов.
Полученные из iPSC кардиомиоциты (iPSC-CMs) сегодня входят в концепцию Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA) и рассматриваются как одна из ключевых альтернатив животным моделям при оценке кардиологической безопасности лекарственных препаратов.
Следующим этапом развития in vitro моделей стали сердечные органоиды. Создаваемые с помощью процессов самоорганизации или микрофлюидных технологий трехмерные модели способны воспроизводить структурные особенности предсердий и желудочков сердца. Такие модели позволяют изучать процессы развития сердечной ткани, моделировать апоптоз и фиброз при остром инфаркте миокарда, проводить высокопроизводительный скрининг соединений, стимулирующих пролиферацию клеток, а также оценивать лекарственно-индуцированную кардиотоксичность.
Сегодня iPSC-CMs и сердечные органоиды находят применение при моделировании заболеваний, разработке лекарственных препаратов и исследованиях в области регенеративной медицины, демонстрируя значительный потенциал в качестве альтернативы традиционным животным моделям и инструмента развития персонализированной медицины.
Применение PhysioX Mapping System для исследования органоидов и iPSC-кардиомиоциотов
Система PhysioX Mapping System позволяет исследовать кальциевую активность и механические сокращения клеток. Перед измерением исследуемые клетки загружаются флуоресцентными красителями для кальция или других ионов. Краситель проникает в цитоплазму, связывается с внутриклеточными ионами кальция, а интенсивность его флуоресценции изменяется в зависимости от колебаний концентрации Ca²⁺.
Высокоскоростная научная CMOS-камера регистрирует динамические изменения флуоресцентного сигнала в режиме реального времени. Система также поддерживает геометрические измерения отдельных клеток, благодаря чему можно одновременно регистрировать кальциевые сигналы и физические изменения, связанные с сокращением клеток. Полученные сигналы преобразуются в цифровые данные и передаются на компьютер для записи, хранения и последующего анализа.
Система картирования PhysioX для анализа кальциевых сигналов и сократительной активности
Оптический путь
Исследуемые образцы
Программное обеспечение для регистрации и анализа данных
Исследование сердечных органоидов с помощью системы PhysioX от SCOPE
Органоиды представляют собой полученные из стволовых клеток трехмерные ткани, культивируемые in vitro и воспроизводящие отдельные структурные и функциональные свойства естественных органов. По сравнению с двумерными клеточными культурами органоиды позволяют точнее моделировать условия, существующие в организме, поэтому становятся важным инструментом фармакологических и патофизиологических исследований.
Из-за разнообразия клеток сердца человека и сложности сердечного микроокружения создание и применение человеческих сердечных органоидов (hCOs) по-прежнему сопряжено с рядом задач. Поэтому точная характеристика функциональных свойств получаемых органоидов имеет особое значение.
Синхронное получение сигналов сократительной способности сердечных органоидов и кальциевого транзиента
Визуализационный анализ внутриклеточной активности кальция в органоидах сердца. Рисунок A. Формы волн кальциевых транзиентов в различных областях интереса (ROI) сердечного органоида. Рисунок B. Динамические изменения внутриклеточных кальциевых транзиентов в сердечном органоиде.
Применение системы картирования PhysioX для исследования iPSC-CMs
Регистрация сокращений и кальциевых транзиентов iPSC-кардиомиоцитов
PhysioX Mapping System может применяться для исследования функциональной активности кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-CMs), включая одновременную регистрацию сократительной активности и внутриклеточных кальциевых транзиентов.
Благодаря полнокадровой съемке образца с тысячами кадров можно получить точные сигналы сокращения и кальциевых транзиентов. Для анализа можно либо анализировать все клетки в поле зрения, либо выделить область интереса (ROI) для выбора отдельных клеток для анализа.
Необработанные данные
Применение системы оптического картирования для исследования органоидов и iPSC-кардиомиоцитов
Система оптического картирования (в центре) и дополнительное оборудование (справа). Слева схематическое изображение оптического пути системы
Загрузка сердца флуоресцентным красителем
Одновременная регистрация потенциала действия и кальциевых транзиентов по десяткам тысяч каналов
Оптическое картирование сердечных органоидов
После облучения рентгеновскими лучами под электронным микроскопом наблюдались изменения в миофибриллах, а также были обнаружены сигналы кальция в органоидах сердца
Поступление ионов кальция является характерным компонентом электромеханического сопряжения в миокарде. Сердечные органоиды обладают пейсмекерной областью, функционально сходной с синоатриальным узлом, которая обеспечивает сокращение всей трехмерной структуры. После рентгеновского облучения при электронной микроскопии были выявлены изменения миофибрилл, что стало основанием для дальнейшего исследования кальциевых сигналов сердечных органоидов.
С помощью высокоразрешающей системы флуоресцентного картирования были изучены изменения кальциевых транзиентов. Оценивались такие параметры, как скорость распространения кальциевого сигнала, дисперсия, амплитуда, частота и время реполяризации. Результаты показали, что применение UCMSCs-sEVs способствовало обратному развитию нарушений кальциевого обмена, вызванных радиационным повреждением.
Литература: Cao H, Yue L, Shao J, et al. Small extracellular vesicles derived from umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate radiation-induced cardiac organoid injury. Stem Cell Res Ther. 2024;15(1):493.
Регистрация кальциевых транзиентов hiPSC-CMs в 24-луночных планшетах
Транзиенты кальция и белки кальциевого цикла в hiPSC-CM, обработанных человеческим инсулином. (a) Репрезентативные измерения транзиентов Ca²⁺ во время спонтанного сокращения (SB) и при электрической стимуляции с частотой 1 Гц, 1,5 Гц и 2 Гц. (b) Репрезентативные наложенные друг на друга кривые транзиентов Ca²⁺ в hiPSC-CM без/с обработкой человеческим инсулином. (c) Средние амплитуды транзиентов Ca²⁺ в hiPSC-CM, подвергнутых воздействию человеческого инсулина и CTL во время спонтанного сокращения (SB) и при электрической стимуляции с частотой 1 Гц, 1,5 Гц и 2 Гц. 4 животных в каждой группе.
Компания Amgen совместно с партнерами опубликовала в журнале Communications Biology исследование «Amylin deposition activates HIF1α and 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3 (PFKFB3) signaling in failing hearts of non-human primates». В исследовании использовалась система высокоразрешающего флуоресцентного картирования OMS-PCIE-2002. Кардиомиоциты человека, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CMs), культивировали в 24-луночном планшете, загружали флуоресцентными красителями и проводили картирование кальциевых транзиентов.
Литература: Liu M, Li N, Qu C, Gao Y, Wu L, Hu LG. Amylin deposition activates HIF1α and 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2, 6-biphosphatase 3 (PFKFB3) signaling in failing hearts of non-human primates. Commun Biol. 2021 Feb 12;4(1):188.
Монослойные культуры iPSC-CMs: регистрация потенциалов действия и кальциевых транзиентов
A, B: Зарегистрированная площадь клетки и положение точки стимуляции. C: Временные кривые внутриклеточной проводимости кальция и карта распределения длительности кальциевого транзиента до и после медикаментозного вмешательства в iPSC-CM.
Клетки высевали в четырехлуночный планшет и окрашивали с использованием Fluo-4. Затем проводилась стимуляция с различной частотой. В ходе эксперимента одновременно регистрировались электрические сигналы клеточного слоя и внутриклеточные кальциевые сигналы, что позволяет комплексно исследовать электрофизиологическую активность iPSC-кардиомиоцитов.
Исследование воздействия микроволнового излучения на iPSC-CMs
В журнале Ecotoxicology and Environmental Safety опубликовано исследование «A temporal study on NF-kB-mediated autonomous inflammatory response in iPSC-CMs induced by microwave radiation», посвященное изучению воспалительного ответа iPSC-кардиомиоцитов после воздействия микроволнового излучения.
Одной из важнейших особенностей кардиомиоцитов является способность к автономным сокращениям. Исследование изменений их электрофизиологических функций помогает изучать механизмы повреждения сердца, связанные с воспалительными процессами. В качестве одного из параметров использовался CaTD90 — длительность кальциевого транзиента на уровне 90%.
Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой (C) время активации Ca²⁺ сначала уменьшалось, а затем увеличивалось через 3 и 6 часов после микроволнового облучения (p < 0,001). Скорость активации Ca²⁺ значительно снижалась через 1 и 3 часа (p < 0,001). Амплитуда кальциевых транзиентов также демонстрировала динамические изменения через 1, 3 и 6 часов после воздействия. Продолжительность CaTD90 сначала увеличивалась, а затем уменьшалась (p < 0,001). Полученные изменения наглядно отображались на зарегистрированных формах сигналов.
Рисунок 2. Электрофизиологическое исследование iPSC-CMs после микроволнового облучения:
A — форма волны проведения Ca²⁺ через 1 час после облучения;
B — через 3 часа;
C — через 6 часов;
D — тепловая карта проведения Ca²⁺ после облучения;
E — статистика времени активации;
F — статистика скорости проведения;
G — статистика амплитуды кальциевых транзиентов;
H — статистика CaTD90.
Группа C — контрольная группа; группа R — группа микроволнового облучения. **p < 0,01; ***p < 0,001; n = 5.
Литература: Ecotoxicology and Environmental Safety. 2025;303:119067. PMID: 40967018.
Применение системы MEA-картирования для исследования iPSC-CMs
Возможности системы электрического картирования
Система электрического картирования позволяет проводить многоэлектродное картирование электрической активности iPSC-кардиомиоцитов. Одно из важных применений метода — оценка зрелости и однородности клеточных культур. Electrical Mapping System позволяет регистрировать пространственное распределение электрических сигналов iPSC-CMs и оценивать различия между партиями клеток, формируя количественные показатели для стандартизации их зрелости.
Другим направлением является поддержка доклинических исследований лекарственных препаратов. Сочетание оптического и электрического картирования с моделями iPSC и органоидов позволяет проводить ранний скрининг проаритмогенного действия препаратов в соответствии с подходами CiPA.
Принцип MEA-картирования
Кардиомиоциты, полученные из iPSC, культивируются непосредственно в чашке с многоэлектродной матрицей (MEA). Клетки располагаются непосредственно на массиве электродов, каждый из которых способен регистрировать генерируемые ими электрические сигналы.
С помощью MEA-картирования могут определяться следующие параметры:
- частота возбуждения;
- локализация пейсмекерного участка;
- направление проведения возбуждения;
- скорость проведения;
- дисперсия проведения;
- дисперсия реполяризации;
- длительность полевого потенциала;
- другие показатели электрической активности клеток.
Регистрация полевых потенциалов iPSC-CMs методом MEA-картирования
A: принцип MEA-картирования и внешний вид системы.
B: изохронные карты проведения до и после введения лекарственного препарата.
C: воздействие 30 нмоль изопротеренола. После введения препарата увеличивается частота активности полевого потенциала и сокращается время реполяризации.
iPSC дифференцировали в кардиомиоциты и культивировали в MEA-чашках. В области каждого из 64 электродов располагалась группа клеток. Регистрация электрических сигналов по каждому каналу позволяла анализировать деполяризацию клеток и определять такие показатели, как время и скорость проведения возбуждения. После этого в культуру можно вводить лекарственные препараты и исследовать их токсическое или терапевтическое действие.
MEA-картирование также позволяет сравнивать электрическую активность клеток с генетически обусловленными нарушениями и нормальных клеток, а также оценивать степень зрелости кардиомиоцитов, полученных в процессе дифференцировки iPSC.
Таким образом, системы SCOPE для оптического, электрического и MEA-картирования предоставляют комплексный набор инструментов для функционального исследования iPSC-кардиомиоцитов и сердечных органоидов. Они позволяют регистрировать потенциалы действия, кальциевые транзиенты, сократительную и электрическую активность клеток и могут применяться в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний, оценке кардиотоксичности, скрининге лекарственных препаратов и разработке современных in vitro моделей сердца.
