Сопряжение возбуждения и сокращения
Кардиомиоциты являются основной клеточной моделью для изучения сердечно-сосудистых заболеваний. Изоляция отдельных кардиомиоцитов из сердечной ткани позволяет исключить влияние сосудистых и нейрогуморальных факторов, обеспечивая проведение целенаправленных исследований эффектов фармакологических, генетических и хирургических воздействий на физиологию клетки на микроскопическом уровне.
С функциональной точки зрения кардиомиоциты представляют собой базовые единицы, обеспечивающие сокращение миокарда. Они обладают полноценной системой сопряжения возбуждения и сокращения (ECC), а также саркомерной структурой, необходимой для осуществления сократительной функции клетки. ECC включает высвобождение ионов кальция из саркоплазматического ретикулума кардиомиоцитов, индуцированное потенциалом действия, что инициирует сокращение клетки. Данный механизм обеспечивает преобразование электрических сигналов (потенциалов действия) в механическую энергию, необходимую для сокращения миокарда и выполнения макроскопической работы. Регуляция внутриклеточной концентрации Ca2+ играет ключевую роль в процессе ECC.
Одновременная регистрация кальциевых сигналов и сократительной активности имеет важное значение для развития кардиологических исследований.
Сопряжение возбуждения и сокращения в сердце, Donald M. Bers. Nature, том 415, 10 января 2002 г.
- Ионы Ca2+ поступают в кардиомиоциты через потенциал-зависимые кальциевые каналы L-типа, расположенные в клеточной мембране. Попадая в цитоплазму, Ca2+ связывается с рианодиновыми рецепторами (RyR) — основными каналами высвобождения Ca2+ в кардиомиоцитах. Это связывание инициирует высвобождение Ca2+ из саркоплазматического ретикулума, что приводит к увеличению его концентрации в цитоплазме.
- Повышенная концентрация Ca2+ в цитоплазме приводит к его связыванию с тропонином, что запускает образование поперечных мостиков между толстыми и тонкими филаментами, вызывая их скольжение и сокращение мышцы.
- После сокращения кальциевая АТФаза саркоплазматического ретикулума (SERCA) активно транспортирует Ca2+ обратно в саркоплазматический ретикулум против градиента концентрации. Одновременно натрий-кальциевый обменник (NCX), расположенный на клеточной мембране, выводит Ca2+ из клетки, инициируя процесс расслабления.
- Затем проницаемость клеточной мембраны для Ca2+ вновь увеличивается, что обеспечивает повторный вход Ca2+ в кардиомиоциты. Этот приток инициирует очередное сокращение, и цикл повторяется, обеспечивая ритмическую сократительную активность сердца.
Измерение и анализ кальциевых сигналов и сократительной активности в изолированных кардиомиоцитах позволяют получить ценные сведения о физиологических и патофизиологических механизмах работы сердца. Передовая система картирования PhysioX от SCOPE является мощным инструментом для регистрации и количественной оценки этих клеточных процессов.
Система картирования PhysioX от SCOPE
Данная система загружает флуоресцентные индикаторы кальция (или других ионов) в исследуемые клетки, где индикаторы проникают в цитоплазму, связываются с внутриклеточными ионами кальция и изменяют интенсивность флуоресценции в зависимости от колебаний концентрации кальция. Высокоскоростная научная CMOS-камера регистрирует эти динамические изменения сигналов в режиме реального времени. Система также обеспечивает геометрическое измерение отдельных клеток, позволяя одновременно регистрировать кальциевые сигналы и физические сократительные изменения. Оба сигнала преобразуются в цифровые данные и передаются на компьютер для регистрации, хранения и анализа.
Система картирования PhysioX
Параметры
- Кальциевые сигналы: длительность кальциевых транзентов (CTD10–90), дисперсия CTD10–90, время до пика и время восстановления, амплитуда, проведение внутриклеточного кальциевого сигнала, видеоролики визуализации внутриклеточной кальциевой активности и др.
- Сократительные сигналы: время сокращения и расслабления, время и скорость сокращения, время и скорость расслабления, длина клетки в состоянии расслабления/сокращения, время сопряжения возбуждения и сокращения (EC).
- Потенциалы действия: время проведения потенциала действия, направление проведения, скорость проведения (CV), дисперсия проведения, скорость деполяризации, время достижения пика деполяризации, длительность потенциала действия (APD10–90), дисперсия APD10–90, видеоролики визуализации потенциалов действия и др.
Оптический тракт
Области применения
- Исследования динамики кальция и различий сократительной активности различных типов клеток.
- Изучение нарушений регуляции кальция (связанных с изменениями функций CaV1.2, RyR2, SERCA) и нарушений сократительной функции, вызванных заболеваниями или генетическими мутациями.
- Скрининг лекарственных препаратов при сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваниях с оценкой их влияния на внутриклеточный кальций.
- Функциональная характеристика органоидов, оценка безопасности лекарственных средств и построение патологических моделей.
- Нейробиологические исследования: мониторинг динамики кальция в нейронах для изучения их возбудимости, синаптической передачи, а также связности и функционирования нейронных сетей
Исследуемые образцы
Подходит для исследования образцов размером 0,1–3 мм, включая клетки, клеточные монослои, органоиды, срезы тканей и другие малые биологические образцы
Программное обеспечение для регистрации и анализа
Принципы работы и характеристики
Принцип регистрации сокращения
Система принимает кадр клеток или органоидов в диастолическом (расслабленном) состоянии в качестве опорного базового уровня и точно фиксирует вызванные движением микродеформации и смещения путём расчёта разности значений яркости соответствующих пикселей между каждым последующим кадром и опорным кадром.
Для образцов органоидов можно выделить всю область органоида в качестве области интереса (ROI) и выполнить общий расчёт значений яркости всех пикселей в данной области для макроскопического отражения общей динамики сокращения и расслабления органоида.
Анализ саркомеров
Принцип одновременной регистрации клеточного сокращения и кальциевых
Клетки, загруженные флуоресцентными индикаторами кальция, размещаются на предметном столике. Для экспериментальной съёмки отбираются клетки с интактной морфологией и без взаимного перекрытия. Светодиодный источник света 1 (зелёный) используется для возбуждения кальциевых транзиентов, а светодиодный источник света 2 (красный) — для возбуждения сигналов сокращения. После облучения клеток этими возбуждающими источниками красный свет проходит через клетки вместе с флуоресценцией индикаторов кальция и поступает в оптический тракт камеры. Дихроичный светоделитель разделяет излучение по длинам волн, после чего каждый спектральный компонент регистрируется и захватывается двумя отдельными камерами.
Характеристики
- Высокая производительность: Система оснащена высокоскоростной камерой с высокой частотой кадров и квантовой эффективностью до 95%, обеспечивает визуализацию динамики внутриклеточного кальция с высоким разрешением на уровне отдельных клеток и точно регистрирует её пространственно-временную активность.
- Высокая пропускная способность: Одновременный прием и анализ сигналов более чем с десяти клеток обеспечивают быстрый сбор данных и существенное повышение экспериментальной производительности.
- Интеллектуальное управление: Поддерживает программируемое сохранение протоколов с синхронизированным управлением стимуляторами, светодиодными источниками, камерами и другим аппаратным обеспечением, гарантируя стабильную работу и высокую воспроизводимость экспериментов.
Система состоит из следующих модулей
Системный контроллер, система микроскопической визуализации и оптического тракта, источник возбуждающего света, стимулятор постоянного тока/напряжения, система контроля температуры, 8-канальная система перфузии и введения препаратов, оптический тракт, источник возбуждающего света.
Основной блок управления
Восьмиканальный цифровой выходной интерфейс обеспечивает синхронную работу нескольких устройств, таких как светодиодные источники возбуждающего света, стимуляторы и камеры. Система отличается удобством эксплуатации и требует участия только одного оператора
Система микроскопической визуализации и оптического тракта
Обеспечивает съёмку изображений микрообъектов и проведение изображений анализа. Двухкамерная оптическая система тракта позволяет одновременно регистрировать сократительную активность клеток, потенциалы действия, кальциевые и другие ионные сигналы.
Светодиодный источник возбуждающего света
Двухканальный светодиодный источник возбуждения обеспечивает стабильное освещение в диапазоне длин волн 400–800 нм для клеток, тканей и целых сердечных препаратов. Интенсивность света точно регулируется за счёт управления током, время быстрой обратной связи составляет не более 60 мкс, что гарантирует постоянство световой интенсивности и длины волны излучения. Встроенная диафрагма позволяет оптически ослаблять световой поток для точной регулировки световой модуляции.
Восьмиканальная система перфузии
Данная система обеспечивает гибкое переключение между восемью различными растворами в программном и ручном режиме. Устройство создано для решения задач лекарственного тестирования на клеточном уровне.
Стимулятор постоянного тока и напряжения
Устройство оснащено встроенной гальванической развязкой и обеспечивает ручной или программный вывод токовой и напряженной стимуляции. Благодаря этому формируются сложные стимуляционные волновые формы тока и напряжения для прямой стимуляции тканей и клеточных образцов ex vivo.
Система контроля температуры
Обеспечивает высокоточное и стабильное поддержание температуры рабочей среды и позволяет выполнять сверхбыструю кратковременную регулировку. Устройство оснащено двумя датчиками, которые одновременно выводят на переднюю панель заданную и фактическую температуру обратной связи без необходимости ручного выбора или переключения режимов. Встроенные фильтрующие элементы и аналоговая схема плавного переключения (slow-ramp) гарантируют исключительно низкий уровень шума при работе.
Программное обеспечение для регистрации и анализа
OMapRecord: современное программное обеспечение для регистрации кальциевых сигналов и сократительной активности клеток
- Высокая производительность: Система оснащена высокоскоростной камерой с высокой частотой кадров и квантовой эффективностью до 95%. Она обеспечивает высококачественную визуализацию внутриклеточной динамики кальция на уровне отдельных клеток с точной фиксацией пространственно-временной активности.
- Высокая пропускная способность: Одновременная регистрация и анализ сигналов более чем от десяти клеток ускоряют сбор данных и существенно повышают пропускную способность экспериментов.
- Интеллектуальное управление: Поддерживает сохранение программируемых экспериментальных протоколов и синхронное управление стимуляторами, светодиодными источниками, камерами и другим оборудованием, гарантируя стабильную работу и высокую воспроизводимость экспериментов
OCellScope: передовое программное обеспечение для анализа кальциевых сигналов и сократимости клеток
- OCellScope — это современное программное обеспечение, специально разработанное для синхронного анализа кальциевых транзиентов и сигналов сократимости. Оно обладает мощными аналитическими возможностями для быстрого просмотра результатов и легкой идентификации сопряжения возбуждения и сокращения (EC-сопряжение).
- Множество встроенных алгоритмов анализа: амплитуда пика (Peak Height), интервал между пиками (Peak Interval), время достижения % от базовой линии (Time to % Baseline), время достижения % от пика (Time to % Peak) и др.
- Маскирование фона с помощью настраиваемых областей исключения позволяет значительно повысить отношение сигнал/шум (SNR) при анализе сократимости. Карты активации формируются одним кликом как для одиночных, так и для усредненных электрических или ионных событий.
- Высокопроизводительная пакетная обработка и анализ файлов ратиометрической визуализации: одновременное открытие нескольких файлов данных с автоматическим формированием отчетов. Поддерживается импорт сигналов ратиометрических индикаторов от различных флуорофоров для генерации и анализа ратиометрических данных.
Примеры применений системы картирования PhysioX для анализа кальциевых сигналов и сократительной активности
Детекция кальциевых транзиентов и сократительной активности в первичных кардиомиоцитах
1. Анализ основных показателей: время сопряжения возбуждения и сокращения (EC), длительность кальциевого транзиента (CTD), время достижения пика (30 %, 70 %, 90 %), время восстановления (30 %, 70 %, 90 %) и амплитуда.
Рисунок A: График времени сопряжения возбуждения и сокращения.
Рисунок B: a/d — время достижения пика кальциевого транзиента; b/e — время восстановления кальциевого транзиента до 90 % от базовой линии; a+b — общая длительность кальциевого транзиента (CTD); c/f — амплитуда сигнала.
2. Визуализация внутриклеточной активности Ca2+ по всей площади клетки для исследования распространения кальция:
Рисунок А: Графики кальциевых транзиентов в различных областях вентрикулярных кардиомиоцитов взрослой крысы.
Рисунок B: Динамическая регистрация процесса внутриклеточных кальциевых транзиентов.
Анализ запасов кальция в саркоплазматическом ретикулуме кардиомиоцитов
Тест на высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума (СР), индуцированный кофеином, является классическим фармакологическим подходом для исследования механизмов внутриклеточной кальциевой сигнализации. Метод позволяет оценить способность внутриклеточных кальциевых депо к высвобождению и соответствующие сигнальные пути (в том числе путь рианодиновых рецепторов RyR2).
- Этап a: Стандартная кривая кальциевого транзиента
- Этап b: Безкальциевый и безнатриевый раствор Тироде
- Этап c: Активация RyR2 с высвобождением кальция для оценки запасов кальция в СР и активности PMCA
- Этап d: Ингибирование RyR2 и натриевых каналов для оценки функции обратного захвата кальция белком SERCA
В представленном исследовании кофеиновый тест использовался для оценки влияния гранул Вэньсинь (WK) на функциональную активность RyR2 и SERCA (Рисунок I). Результаты показали существенные различия в регуляции внутриклеточного кальция в предсердных кардиомиоцитах у группы WK. Константа наклона RyR2 (скорость процесса RyR2 = 45,33 ± 25,71) и константа наклона SERCA (обратная величина скорости SERCA = 3,95 ± 1,86) у группы WK были значительно ниже, чем в контрольной группе (скорость RyR2 = 74,90 ± 24,75; обратная величина скорости SERCA = 8,97 ± 3,50; P < 0,01 и P < 0,05). Полученные данные подтверждают, что препарат WK замедляет высвобождение кальция, опосредованное рианодиновыми рецепторами RyR2, а также обратный захват кальция при участии белка SERCA
Литература: Liang Y, Wang G, Fan S, Zhang J, He S, Pan G, Hao G, Zhu Y. Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation. Theranostics. 2024 Oct 7;14(17):6625-6651.
Детекция сократительной активности и кальциевых транзиентов в клетках iPSC-CM
Кардиомиоциты, дифференцированные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CM), имеют высокий потенциал в изучении развития сердца, моделировании сердечных заболеваний и лекарственном скрининге. Одновременная регистрация сократительной функции и кальциевых транзиентов занимает ключевое место в фундаментальных исследованиях, изучении патогенеза заболеваний, разработке лекарственных средств и регенеративной медицине.
Полнокадровая съёмка образцов с записью тысяч кадров позволяет регистрировать высокоточные сигналы сократительной активности и кальциевых транзиентов. При анализе доступна оценка всех клеток в поле зрения либо выбор отдельных клеток для целевого исследования путём выделения индивидуальной области интереса (ROI).
Необработанные данные
Электрофизиологическое картирование сердечных органоидов
Органоиды — это трехмерные ткани (3D), полученные из стволовых клеток и культивируемые in vitro. Они имитируют структуру и функции естественных органов. По сравнению с двумерными (2D) клеточными культурами они точнее воспроизводят внутриклеточное микроокружение органов in vivo, являясь ключевым инструментом для лекарственных и патологических исследований. Из-за разнообразия сердечных клеток человека и сложности сердечного микроокружения разработка и применение человеческих сердечных органоидов (hCO) по-прежнему сопряжены с существенными трудностями, поэтому детальная характеристика свойств органоидов имеет особое значение.
Синхронная регистрация сократительной активности и кальциевых транзиентов сердечных органоидов
Визуальный анализ внутриклеточной кальциевой активности в сердечных органоидах
Рисунок A: Графики кальциевых транзиентов в различных зонах ROI сердечного органоида.
Рисунок B: Динамические изменения внутриклеточных кальциевых транзиентов в сердечном органоиде
Измерение кальциевых транзиентов в гладкомышечных клетках
Внутриклеточная динамика кальция в сосудистых гладкомышечных клетках (VSMC) лежит в основе нормального сокращения и расслабления сосудов. Кальциевая визуализация является незаменимым ключевым инструментом сердечно-сосудистых исследований: она охватывает фундаментальную регуляцию сосудистого тонуса, патогенез артериальной гипертензии и атеросклероза, а также разработку и оценку новых кардиоваскулярных препаратов, связывая молекулярные процессы (активность ионных каналов) с макроскопической функцией сосудов.
Гладкомышечные клетки брюшной аорты крыс линии SD
Реакция VSMC на ангиотензин II (Ang II)
Реакция VSMC на кофеин
Реакция сосудистой ткани на фенилэфрин (PE)
Визуализация внутриклеточного кальция в сосудистых гладкомышечных клетках имеет важное значение в нескольких направлениях:
- Фундаментальные исследования: раскрытие базовых механизмов регуляции артериального давления и вазомоторной активности сосудов.
- Изучение патологий: анализ патогенеза гипертонии, атеросклероза и других сосудистых заболеваний.
- Лекарственный скрининг: быстрая оценка влияния антигипертензивных и инновационных препаратов на клеточные кальциевые сигналы.
Таким образом, данный метод служит важнейшим инструментом для изучения ключевых сигналов, регулирующих сосудистую активность.
Детекция кальциевых транзиентов в скелетных мышцах
Мышечные волокна, как функциональные единицы скелетных мышц, образуются в ходе эмбриогенеза при слиянии миобластов (одноядерных клеток) в миотрубки (многоядерные клетки). Сократительные свойства короткого сгибателя пальцев стопы (FDB) мыши — быстрое сокращение, умеренное развиваемое напряжение, утомляемость и тонкая регуляция — полностью соответствуют его основной функции, связанной с обеспечением быстрого сгибания пальцев стопы:
- Преобладание быстросокращающихся мышечных волокон, обеспечивающих быструю двигательную активность.
- Небольшие двигательные единицы, отвечающие за точную мелкую моторику.
- Метаболизм, основанный на гликолизе, адаптированный к прерывистому сокращению; при этом длительная устойчивость к утомлению не требуется
Таким образом, данный метод является важнейшим инструментом для изучения ключевых сигналов, регулирующих активность скелетных мышц.
Синхронная регистрация сократительной активности и кальциевых транзиентов в волокнах скелетных мышц
Анализ одиночных и тетанических сокращений
Данная методика выделения мышечных волокон обладает огромным потенциалом для ускорения исследований в области физиологии скелетных мышц и создания высокоэффективной платформы для скрининга лекарственных препаратов ex vivo в рамках изучения мышечных заболеваний и разработки методов регенеративной терапии.
Одновременная регистрация потенциалов действия и кальциевых транзиентов в сердце зебрафиш
Визуализация потенциалов действия и кальциевых сигналов в изолированных сердцах зебрафиш
- Рисунок A: Схема областей мечения сердечной ткани.
- Рисунок B: Карты активации потенциалов действия в контрольной и опытной (лекарственно обработанной) группах.
- Рисунок C: Типичные графики потенциалов действия в контрольной и опытной группах
- Рисунок D: Карты длительности потенциала действия (APD) для обеих групп
- Рисунок A: Схема областей мечения сердечной ткани.
- Рисунок B: Карты активации кальциевых транзиентов в контрольной и опытной группах.
- Рисунок C: Типичные графики кальциевых транзиентов в контрольной и опытной группах
- Рисунок D: Карты длительности кальциевого транзиента (CTD) для обеих групп
Исследование органоидов
Органоиды представляют собой трёхмерные ткани, полученные из стволовых клеток и культивируемые in vitro. Они предназначены для воспроизведения структуры и функций органов. В отличие от традиционных двумерных (2D) клеточных культур, органоиды обеспечивают более реалистичное воспроизведение микроокружения органов in vivo. Благодаря этому они являются важным инструментом для разработки лекарственных препаратов и изучения патологических процессов. Однако создание и применение органоидов сердца человека (hCO) сопряжено с определёнными трудностями из-за разнообразия клеток сердца человека и сложности их микроокружения.
Для оценки свойств органоидов важно определять такие параметры, как время сопряжения возбуждения и сокращения (E–C), длительность кальциевого транзиента (CTD), время достижения пика (30%, 70%, 90%) и время восстановления (30%, 70%, 90%), а также амплитуду. Эти параметры играют важную роль в изучении функциональных характеристик органоидов и оценке их применимости в биомедицинских исследованиях.
- Рисунок A: Схематическое изображение длительности кальциевого транзиента (CTD30, CTD90).
- Рисунок B: Характерные кривые кальциевых транзиентов до и после введения препарата.
- Рисунок C: Статистический график CTD90 до и после введения препарата.
- Рисунок D: Статистический график CTD30 до и после введения препарата.
- Рисунок E: Статистически й график отношения CTD30/80 до и после введения препарата.
- Рисунок F: Статистический гр фик межквартильного размаха (IQR) до и после введения препарата.
Результаты: совместная инкубация с ингибитором hERG цизапридом (Cisapride, 1 мкМ) и активатором позднего натриевого тока ATX-II (3 нМ) увеличивает длительность кальциевого транзиента, не вызывая ранних постдеполяризаций (EAD).
