Кардиомиоциты являются одной из основных клеточных моделей для изучения физиологии сердца и механизмов развития сердечно-сосудистых заболеваний. Выделение отдельных кардиомиоцитов позволяет исключить влияние сосудистых и нейрогуморальных факторов и исследовать на клеточном уровне эффекты фармакологических, генетических и хирургических воздействий.
Кардиомиоциты — основные функциональные клетки миокарда, обеспечивающие сокращение сердечной мышцы. Они обладают полноценной системой сопряжения возбуждения и сокращения (excitation-contraction coupling, ECC) и саркомерными структурами, непосредственно участвующими в сокращении клетки.
При сопряжении возбуждения и сокращения потенциал действия запускает высвобождение Ca²⁺ из саркоплазматического ретикулума, что, в свою очередь, вызывает сокращение кардиомиоцита. Таким образом электрическая энергия потенциала действия преобразуется в механическую энергию сокращения, обеспечивая работу сердца. Ключевую роль в этом процессе играет регуляция внутриклеточного Ca²⁺. Поэтому одновременное измерение кальциевых сигналов и сократимости кардиомиоцитов имеет особое значение для исследований физиологии и патофизиологии сердца.
Системы SCOPE для оптического картирования, визуализации кальция и анализа сократимости позволяют регистрировать и анализировать кальциевые сигналы, потенциалы действия и механические сокращения кардиомиоцитов.
Применение системы картирования PhysioX для исследования кардиомиоцитов
Система картирования PhysioX от SCOPE позволяет исследовать кальциевую активность и механические сокращения клеток. Перед измерением исследуемые клетки загружаются флуоресцентными красителями для кальция или других ионов. Краситель проникает в цитоплазму, связывается с внутриклеточными ионами кальция, а интенсивность его флуоресценции изменяется в зависимости от колебаний концентрации Ca²⁺.
Высокоскоростная научная CMOS-камера регистрирует динамические изменения флуоресцентного сигнала в режиме реального времени. Система также поддерживает геометрические измерения отдельных клеток, благодаря чему можно одновременно регистрировать кальциевые сигналы и физические изменения, связанные с сокращением клеток. Полученные сигналы преобразуются в цифровые данные и передаются на компьютер для записи, хранения и последующего анализа.
Система картирования PhysioX для анализа кальциевых сигналов и сократительной активности
Оптический путь
Исследуемые образцы
Программное обеспечение для регистрации и анализа данных
Регистрация кальциевых транзиентов и сокращения первичных кардиомиоцитов
PhysioX Mapping System позволяет одновременно исследовать динамику внутриклеточного Ca²⁺ и сократительную активность первичных кардиомиоцитов. Полученные данные могут использоваться для анализа сопряжения возбуждения и сокращения (ECC) и количественной оценки основных параметров кальциевого сигнала и сократимости.
Регистрация кальциевых транзиентов и сократительной активности в первичных кардиомиоцитах. Справа: форма волны возбуждения-сокращения: a, d: Время достижения пика; b, e: Время восстановления до 90%; a+b: Длительность; c, f: Амплитуда
Визуализация внутриклеточного кальция
Визуализация внутриклеточного Ca²⁺ может применяться для исследования распространения кальциевого сигнала внутри кардиомиоцита. Система позволяет получать и сравнивать кривые кальциевых транзиентов в различных областях кардиомиоцитов. В качестве примера представлены кривые кальциевых транзиентов, зарегистрированные в различных областях кардиомиоцитов желудочков взрослых крыс.
Графики, показывающие кальциевые транзиенты в различных областях желудочковых миоцитов взрослых крыс
Анализ саркомеров кардиомиоцитов
Во время сокращения кардиомиоцита расстояние между чередующимися тёмными и светлыми полосами, образованными A- и I-дисками, периодически уменьшается и увеличивается.
Специализированный модуль анализа саркомеров кардиомиоцитов позволяет оценивать эту периодическую структуру изображения. С помощью алгоритма быстрого преобразования Фурье (Fast Fourier Transform, FFT) рассчитывается доминирующая пространственная частота, на основании которой может быть точно определена средняя длина саркомера. Такой анализ позволяет количественно оценивать изменения саркомерной структуры в процессе сокращения кардиомиоцитов.
Caffeine Assay — исследование кальциевого обмена с помощью кофеина
Кофеиновый тест (Caffeine Assay) широко применяется в клеточной биологии для исследования механизмов внутриклеточной кальциевой сигнализации. В частности, метод позволяет изучать способность внутриклеточных депо кальция, включая саркоплазматический ретикулум (SR), высвобождать Ca²⁺, а также анализировать связанные сигнальные механизмы, в том числе работу рианодиновых рецепторов.
- кальциевый транзиент и запас Ca²⁺ в саркоплазматическом ретикулуме;
- кальциевый транзиент, запас и утечка Ca²⁺ из SR, функции RyR/SERCA и активность PMCA;
- кальциевый транзиент, запас и утечка Ca²⁺ из SR, функции RyR/SERCA, активность PMCA и NCX.
Таким образом, системы анализа кальциевой динамики и сократимости позволяют комплексно исследовать механизмы регуляции внутриклеточного кальция в кардиомиоцитах.
Пример применения системы SCOPE в научном исследовании
Система для картирования кальциевых сигналов и сократимости была использована в исследовании механизмов развития фибрилляции предсердий после ишемического инсульта.
Для оценки влияния WK на функции RyR2 и SERCA исследователи применяли систему картирования PhysioX от SCOPE. Исследование на уровне отдельных клеток позволило получить данные высокого разрешения о регуляции кальциевого обмена и сократимости, дополнив результаты оптического картирования на уровне ткани. Специализированный экспериментальный протокол позволил разделить механизмы высвобождения и поглощения Ca²⁺ и оценить влияние WK на ключевые белки, участвующие в регуляции внутриклеточного кальция.
(I) Графическое представление протокола оценки потоков Ca2+ в саркоплазматическом ретикулуме (СР) [a: основные параметры транзиентного изменения концентрации Ca2+, b: утечка Ca2+ из RyR, c: содержание Ca2+ в СР, d: активность SERCA; NT, нормальный раствор Тироде. (J, K) Количественная оценка функций констант скорости RyR2 и SERCA.
Публикация: Liang Y., Wang G., Fan S. et al. Brain-to-heart cholinergic synapse-calcium signaling mediates ischemic stroke-induced atrial fibrillation. Theranostics. 2024; 14(17): 6625–6651.
Применение системы оптического картирования SCOPE для исследования кардиомиоцитов
Система оптического картирования (в центре) и дополнительное оборудование (справа). Слева схематическое изображение оптического пути системы
Загрузка сердца флуоресцентным красителем
Одновременная регистрация потенциала действия и кальциевых транзиентов по десяткам тысяч каналов
Регистрация потенциала действия и кальциевых транзиентов в монослое неонатальных кардиомиоцитов желудочков крысы
Система оптического картирования позволяет исследовать электрическую активность и динамику внутриклеточного кальция в культурах кардиомиоцитов. A: регистрация кальциевого сигнала в культуре неонатальных кардиомиоцитов желудочков крысы (NRVM) в чашке диаметром 3,5 см с использованием Rhod-2. B: регистрация потенциала действия с использованием FluoVolt.
|
|
Calcium Transient (CaT) — кальциевый транзиент
|
|
Action Potential (AP) — потенциал действия.
Возможности систем SCOPE для исследований кардиомиоцитов
Оборудование SCOPE позволяет проводить комплексные исследования электрофизиологии, кальциевой динамики и сократимости кардиомиоцитов. Системы могут применяться для регистрации потенциалов действия и кальциевых транзиентов, анализа сопряжения возбуждения и сокращения, визуализации распространения внутриклеточного Ca²⁺, оценки сократительной активности и длины саркомеров, а также исследования механизмов работы саркоплазматического ретикулума и белков, регулирующих кальциевый обмен.
Такие возможности делают системы SCOPE инструментом для фундаментальных и прикладных исследований физиологии сердца, механизмов сердечно-сосудистых заболеваний и действия различных экспериментальных воздействий на кардиомиоциты
