sCMOS и EMCCD камеры Andor для микроскопии сверхвысокого разрешения

Чуть более десяти лет назад Сяовей Чжуан (Xiaowei Zhuang) и ее команда разработали новую технику визуализации методом микроскопии, которая изменила изучение клеток. STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), или микроскопия стохастической оптической реконструкции, основанная на реконструкции изображения в сверхвысоком разрешении благодаря информации о точной локализации отдельных флуорохромов, привнесла значительный импульс в уже развивающуюся область микроскопии сверхвысокого разрешения, в которой использовались друге различные методы, включая STED (STimulated Emission Depletion - метод подавления спонтанного испускания), впервые предложенный Штефаном Хеллем (Stefan Hell) и его коллегами в Геттингене в середине 2000-х годов. Теперь, спустя более 10 лет, Сяовэй Чжуан была награждена премией за прорыв в области естественных наук в 2019 году за свои новаторские исследования. 

В середине 2000-х годов методы сверхвысокого разрешения стали быстро развиваться как инструмент для многих исследователей, работающих с передовыми микроскопическими изображениями, и чьи усилия по изучению клеточной микроокружающей среды были до того момента затруднены, казалось бы, непреодолимым пределом разрешения оптических систем, которые они использовали. Это означало, что изображения любых объектов, расположенных на расстоянии друг от друга ближе, чем 200 нм сливались в единое пятно на конечном снимке. Это было серьезной проблемой для любого биолога, кто хотел изучать и различать молекулы на расстояниях меньших этого предела. Многие фундаментальные биологические процессы происходят в гораздо меньших масштабах - от одного до нескольких десятков нанометров - и изучение этой области с помощью типовых и доступных инструментов для микроскопии откроет совершенно новые возможности для фундаментальных и прикладных исследований.

Метод STORM, использованный лабораторией Сяовэй Чжуан, отличался от STED, поскольку он основывался на последовательном включении и выключении флуорофоров в установке, основанной на широкопольном микроскопе. На основе субпопуляций этих молекул, излучающих свет в любой данный момент времени, стало возможным выяснить или локализовать место, где эти светоизлучающие молекулы находились внутри клетки или одной из ее многочисленных органелл. Делая многократные снимки различных субпопуляций, излучающих свет в разные моменты времени и снимая их с помощью сверхчувствительной  EMCCD камеры, стало возможным создать полное изображение с отдельными положениями бесчисленных флуорофоров с разрешением до 20 нм.

STORM и другие подобные методы локализации полагаются на детектирование отдельных флуорофоров. Это может быть сложной задачей в зависимости от типов используемых флуорофоров, и в некоторых случаях такие микроскопические системы будут нуждаться в камере с самой высокой чувствительностью. Камеры EMCCD  зарекомендовали себя как идеальные системы визуализации для микроскопии сверхвысокого разрешения. Их высокая квантовая эффективность, превышающая 95%, низкий уровень шума и возможности умножения электронов (EM) означают, что даже более слабые флуорофоры с более низким выходом фотонов могут быть эффективно детектированы камерой. Это, в свою очередь, оказало непосредственное влияние на точность локализации расположения и определения флуорофоров и, следовательно, биомолекул, представляющих интерес.

Камеры iXon EMCCD компании Andor были одними из первых приборов визуализации для методов детектирования одиночных молекул и остаются лучшим выбором для многих типов и методов микроскопии сверхвысокого разрешения. В своей статье 2006 года Сяовэй Чжуан и коллеги используют модель iXon EMCCD с разрешением 512x512 пикселей. Появление и постоянное совершенствование научных CMOS (sCMOS) камер позволило этой технологии визуализации также проникнуть в микроскопию сверхразрешения, и вполне вероятно, что обе технологии будут сосуществовать, удовлетворяя различные потребности в различных типах изображений со сверхразрешением.

Применение метода STORM очень разнообразно и теперь этот метод можно встретить во всех областях исследований биоизображений. Они включают исследования характеристик флуорофоров (2), перестройки цитоскелета (3), кластеризации рецепторов (4), ВИЧ-инфекции (5), субкортикальных очагов в белом веществе головного мозга (6) или изучение функции языковых мышц (7), и многие другие биологические исследования публикуются с помощью камер Andor iXon EMCCDs каждую неделю.

3D STORM демонстрирует взаимодействия между клеточными структурами с нанометровым разрешением. Съемка производилась на Olympus IX71, оборудованным Andor iXon 897 EMCCD

Цельноклеточная 3D STORM микроскопия выявляет взаимодействия между клеточными структурами с нанометровым разрешением. На рисунке представлено сравнение обычного и трехмерного STORM-изображения митохондрий в клетке. Левая часть рисунка показывает обычное изображение левой 1/3 части клетки. Средняя часть рисунка показывает 3D STORM изображение средней 1/3 части клетки. Информация о расстоянии по оси z в глубину клетки имеет цветовую кодировку. Правая часть рисунка показывает xy поперечное сечение 3D STORM-изображения правой 1/3 части клетки. TOM20 в митохондриях иммунологически помечен фотоактивируемыми красителями. Съемка была сделана на микроскопе Olympus IX71, оборудованном камерой Andor iXon 897 EMCCD.

Литература