Топ 10 советов для достижения максимальной производительности вашей камеры для микроскопии

В этой статье д-р Алан Муллан, специалист Andor Technology по камерам для микроскопов, делится несколькими простыми советами о том, как получить максимальную производительность от камеры для съемки на вашем микроскопе. Несмотря на то, что камера не может компенсировать неоптимальные условия выборки или подготовки исследуемого образца, безусловно, возможно получить максимальную отдачу от вашей камеры и достичь наилучшее из возможного качество получаемого изображения. Некоторые из этих советов могут показаться простыми, но их легко упустить из виду, поскольку мы сосредоточены на предстоящих задачах исследования.

1. Подключение

Многие камеры для микроскопов используют интерфейс USB 2.0 и USB 3.0 как удобную систему для связи с ПК и передачи данных о получаемом изображении. В некоторых камерах применяются другие высокоскоростные интерфейсы связи, такие как CoXpress или Cameralink. Независимо от интерфейса управления с компьютера, в ПК обычно есть собственная PCIe плата, и рекомендуется, чтобы эта плата была предназначена для работы именно с камерой. Совместное использование ресурсов с другими устройствами пользователя может привести к потере производительности, а также потенциально может возникнуть сбой в захвате изображения или несовместимая и/или сниженная скорость кадров. По этой причине компания Andor поставляет специализированную PCIe плату для надежного и стабильного подключения камеры к ПК.

2. Готовность к работе

Современные компьютеры по умолчанию обычно имеют включенные режимы энергосбережения. Несмотря на то, что эта функция полезна для сохранения окружающей среды и снижает затраты на электроэнергию, они могут нарушить связь камеры с ПК во время сбора данных или запуска событий. По этой причине параметры энергосбережения должны быть отключены для платы PCIe/платы управления камерой. Это легко сделать в настройках диспетчера устройств вашего компьютера.

3. Идеальное соединение

Различные микроскопы имеют разные размеры портов и варианты крепления камер. Они могут варьироваться в размерах от 18 до 22 мм через C-mount крепление. Кроме того, размер порта микроскопов от 25 до 32 мм теперь доступны либо через F-mount крепление и адаптер камеры, либо через T-mount крепление для микроскопа. Камеры также поставляются с различными размерами сенсоров и количеством пикселей, и в настоящее время даже существуют камеры, которые имеют сенсоры большего размера, чем размеры портов микроскопа. Стоит отметить следующие две особенности:

- Сопоставьте размер порта микроскопа (указанный как полевое число (FN) в мм) с размером сенсора камеры. Если у камеры размер сенсора намного больше, чем размер порта микроскопа, Вы не получите полное разрешение и поле обзора, на которые способна Ваша камера. Если сенсор недостаточно заполнен размером порта микроскопа, у Вас может быть эффект виньетирования (темная область по краям).

- Эффекты виньетирования - видимые как темные области в углах левого изображения могут быть вызваны тем, что поле зрения камеры не соответствует размеру порта микроскопа. Это можно исправить, как показано на правом изображении, используя дополнительное увеличение. Для этого может быть добавлено дополнительное увеличение после объектива для обеспечения правильного соответствия поля зрения камеры и размера порта микроскопа. У большинства производителей микроскопов есть такие наборы (иногда называемые Optovars или муфты с увеличительными линзами), и некоторые из них уже могут быть интегрированы в конструкцию микроскопа, например, в микроскопах Nikon Ti.

- Соотнесите размер пикселя камеры с объективом. Это важно для того, чтобы изображение было достаточно передискретизировано, чтобы соответствовать критерию Найквиста. Разрешение микроскопа ограничивается эффектом дифракции и определяется главным образом числовой апертурой (NA) объектива, т.е. разрешение определяется как соотношение λ/(2NA). Например, камера Andor Sona 4.2B-11 имеет размер пикселя 11 мкм и при увеличении х100 соответствует критерию Найквиста. Чтобы выполнить критерий Найквиста при 40-кратном увеличении требуется дополнительное 2-кратное увеличение, чтобы уменьшить эффективный размер пикселя до 5.5 мкм. В типовых применениях лучше не превышать выборку по сравнению с критерием Найквиста, так как меньшие размеры пикселя означают снижение соотношения сигнала к шуму. Однако методы микроскопии сверхвысокого разрешения, основанные на локализации, такие как PALM, STORM или SRRF-Stream от Andor, могут выиграть от повышенной передискретизации.

4. Регулярное обновление программного обеспечения

Программное обеспечение для управления камерой всегда должно быть самой последней доступной версией, чтобы обеспечить максимальную производительность камеры. Как и все программное обеспечение, новые функции, а также исправления ошибок включены в последнюю версию. Для некоторых программ, таких как Micro-Manager «Nightly builds» или NIS-elements, могут быть доступны «горячие патчи», которые обеспечивают улучшенную поддержку камер на регулярной основе. Другое программное обеспечение может выпускаться реже как полная версия. Каким бы ни был график выпуска программного обеспечения, важно, чтобы вы были в курсе последних обновлений.

5. Сокращение экспозиции

Как правило, мы хотим установить как можно более низкие значения экспозиции и интенсивности освещения, чтобы получить наиболее точные измерения физиологии клеток, особенно для визуализации живых клеток. Современные флуорофоры более яркие и стабильные, а в сочетании с высокочувствительными камерами позволяют проводить эксперименты с низкими концентрациями флуорофора.

Камеры, как правило, наиболее чувствительны в спектральном диапазоне около 500-650 нм, что соответствует максимальному высвечиванию многих основных флуорофоров в исследованиях живых клеток, таких как GFP. Поэтому, имейте в виду, что при работе вне этой стандартной спектральной области по направлению к ультрафиолетовому или ближнему инфракрасному диапазонам спектра квантовая эффективность регистрации камеры или QE (мера чувствительности камеры к свету) будет падать, и может потребоваться соответствующее увеличение экспозиции.

Разные сенсоры камер будут иметь разный отклик квантовой эффективности на длину волны света, поэтому Вы должны проверить кривую квантовой эффективности (QE) характерную для Вашей модели камеры, чтобы Вы могли оценить ее влияние на Ваши эксперименты. Некоторые камеры, такие как серия iXon Ultra от Andor, имеют специальные варианты покрытия сенсоров, разработанные для высокой чувствительности на длинах волн в ультрафиолетовой и ближней инфракрасной области спектра.

6. Настройте sCMOS камеру для наилучшего качества изображения

Камеры sCMOS очень гибки в плане обработки изображений и имеют множество доступных настроек. Поэтому важно убедиться, что они установлены в соответствии с проводимым экспериментом. Для высокоскоростной визуализации Вы должны искать настройки высокой скорости, иногда это может называться «12-битным режимом». Для получения изображений с большим динамическим диапазоном Вы должны искать высокий динамический диапазон, который иногда отображается как «16-битный» режим. Существует также ряд режимов запуска - для получения полной информации обратитесь к руководству по эксплуатации вашей камеры.

7. Настройте EMCCD камеру для наилучшего качества изображения

Для камер EMCCD есть некоторые дополнительные настройки, такие как усиление электронного умножения EM, которые необходимо учитывать. Это может показаться немного запутанным, однако есть некоторые общие рекомендации. Например, Вы не должны увеличивать усиление EM сверх того уровня, который Вам нужен. Увеличение усиления EM может привести к так называемому старению электронного умножения, что со временем приведет к снижению чувствительности камеры. Компания Andor упростила настройку камер iXon EMCCD, используя предустановленные параметры, называемые Optaquire, которые упрощают выбор оптимальных настроек для экспериментов, таких как максимальная чувствительность или более высокие скорости получения изображений. Это также отличная отправная точка для базовых настроек сбора данных для пользовательских экспериментальных установок.

8. Скорость работы

Есть несколько способов получить лучшее временное разрешение для быстро движущихся объектов или процессов.

- Большинство камер предлагают возможность обрезать сенсор до области интереса (ROI) и значительно увеличить частоту кадров. Например, при меньших размерах ROI камера Andor Zyla 4.2 PLUS способна вести сьемку со скоростью 1627 кадров в секунду по сравнению с типовыми 100 кадрами в секунду при полном разрешении (2048x2048). Таким образом, когда важна скорость, например, для получения изображений с кальцием, это хороший вариант. Будет установлено время считывания для каждого столбца или строки, поэтому скорость в конечном итоге будет определяться скоростью считывания сенсора в камере. Для камер EMCCD используйте аксессуар Optomask для доступа к максимально возможным скоростям при использовании режима кадрирования.

- Уменьшите время выдержки. Более короткие выдержки, конечно, означают более высокие скорости. Для на более высоких скоростях важна высокая чувствительность камеры, поскольку мы можем избежать коротких экспозиций и получить хороший сигнал.

- Большинство sCMOS камер работают в режиме, который называется Rolling Shutter, так как это обеспечивает минимальный уровень шума и подходит для большинства применений. Однако для некоторых очень быстро движущихся объектов такая схема считывания с сенсора может привести к искажению изображения. В этих случаях камеры, которые предлагают режим затвора Gobal Shutter, такие как Andor Neo 5.5, могут предоставить режим «моментального снимка», который позволяет избежать этого эффекта.

9. Помните об охлаждении

Выделение тепла при работе камеры – крайне нежелательный эффект с точки зрения получения изображений высокого качества. Типовые камеры для микроскопии могут иметь пассивное охлаждение или вообще не охлаждаться, что означает, что изображение может иметь намного более высокий уровеньшума, чем хотелось бы пользователю. Поскольку время экспозиции увеличивается, а шум темнового тока становится доминирующим фактором, выделение тепла при работе камеры становится проблемой. По этой причине в научных камерах, как правило, используется активный тип охлаждения, чтобы максимально снизить шум темнового тока. Для sCMOS камер охлаждение также удаляет другие типы шума, такие как горячие пиксели или пятна. Охлаждение сенсора позволяет нам не только получить более качественное изображение с более высокой точностью воспроизведения, но и камера будет более чувствительной при получении изображения поскольку минимальный уровень шума был снижен. В камерах Andor, таких как sCMOS камера Sona с задней подсветкой, используется постоянный вакуумный кожух для сенсора по технологии UltraVac™, что означает максимально глубокое охлаждение.

Как общее примечание, обязательно следуйте рекомендациям производителя о диапазоне рабочих температур, чтобы камера могла полностью охлаждаться.

10. Рассмотрите возможность обновления Вашей камеры до новой модели

Если Вы используете свою камеру в течение продолжительного времени, возможно, новая модель камеры придаст новый импульс улучшению качества работы Вашего микроскопа и раскроет его потенциал:

- Если у Вас была более старая цветная ПЗС камера или ПЗС камера с буферизацией столбцов (interline CCD), обновление до новой камеры sCMOS, такой как Zyla 4.2 PLUS, обеспечит повышенную чувствительность, более высокие скорости и разрешение. Это действительно изменит качество данных получаемого изображения исследуемого образца, которые вы можете достичь, и при этом не выходя за рамки исследовательского бюджета. Имейте в виду, что камеры с высокой чувствительностью черно-белые, а не цветные.

- Если Вы пользовались в течение нескольких лет sCMOS камерой, то Вы можете посмотреть на камеры sCMOS последнего поколения с задней подсветкой, такие как Sona 4.2B-11. Эти камеры предлагают почти идеальную квантовую эффективность QE в 95% для более высокой чувствительности, сохраняя при этом более широкое поле зрения и высокие скорости считывания, которыми известны камеры sCMOS.

- Наконец, если у Вас есть более старая EMCCD камера, то новые модели, такие как iXon Life 888, будут обеспечивать ту же чувствительность EMCCD камеры, но позволят получить более высокое разрешение и скорость. Кроме того, последнее поколение sCMOS камер с задней подсветкой, такие как Sona 4.2B-11, обеспечивают исключительную чувствительность, что означает, что для всех, кроме самых низких уровней света, они обеспечивают улучшенное соотношение сигнал/шум, более высокие скорости и более широкое поле зрения.