Арт. 80806 / 80801 / 80802 / 80804 / 80809
Мануэль Искьердо, кафедра биохимии, Институт биомедицинских исследований им. Альберто Солса
Клеточный иммунный ответ, проявляемый Т-лимфоцитами, имеет важное значение в борьбе организма с патогенами, включая вирус, вызывающий COVID. Наиболее эффективными являются вакцины, способные вызывать в организме действенный и стойкий иммунный ответ, как гуморальный (активация В-лимфоцитов и продукция антител), так и клеточный (активация Т-лимфоцитов и образование Т-лимфоцитов памяти). Т-клетки памяти «помнят патоген» и имеют антигенный рецептор, способный распознавать антигены патогена (например, вирус) в следующий раз, когда встречается инфекция, чтобы убить инфицированную клетку. Знание молекулярных основ, регулирующих активность Т-лимфоцитов, специально направленных против патогенов, в контексте формирования иммунных синапсов является ключом к благоприятствованию и модификации ответов лимфоцитов и будет способствовать разработке новых стратегий вакцинации.
Конфокальное изображение Т-лимфоцита Jurkat (внизу), образующего иммунологический синапс с антигенпрезентирующей клеткой (вверху, синий). Нитевидный актин визуализируется зеленым цветом. Мультивезикулярные тельца пурпурного цвета. Клетки визуализировали на 8-луночной слайд-камере µ-Slide ibidi.
Активация Т- и В-лимфоцитов антигенпрезентирующими клетками (АПК) происходит при специализированном взаимодействии клеток, называемом иммунологическим синапсом (ИС). Образование ИС Т- и В-лимфоцитами — очень динамичное, пластичное и ответственное событие, действующее как настраиваемая сигнальная платформа, объединяющая пространственные, механические и биохимические сигналы, участвующие в антиген-специфических, клеточных и гуморальных иммунных реакциях. Таким образом, формирование ИС Т- и В-лимфоцитами является ключевым событием в ходе иммунных ответов.
Формирование ИС связано с начальным увеличением содержания F-актина в коре головного мозга в области ИС, за которым следует снижение плотности F-актина в центральной области ИС, включающей секреторный домен. Основные сигнальные пути, регулирующие актин, включают процессы фосфорилирования членами семейства протеинкиназ C.
После формирования ИС Т-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (АПК) в поляризованной секреции участвует конвергенция секреторных везикул, в том числе мультивезикулярных тел (МВТ), к центру организации микротрубочек (ЦМОТ) и поляризация ЦМОТ к ИС в синаптической щели. Поляризованная секреция экзосом в иммунологическом синапсе является развивающейся и сложной областью исследований, связанных с соответствующими иммунными реакциями. Было продемонстрировано, что мультивезикулярные тельца (МВТ), представляющие собой внутриклеточные гранулы, окруженные CD63, несущие внутрипросветные везикулы (ВПВ), испытывают поляризованный транспорт в направлении ИС, после стимуляция Т-клеточный рецептор (ТКР) антигеном. Слияние этих МВТ на синаптической мембране вызывает их дегрануляцию и высвобождение ВПВ в виде экзосом в синаптическую щель.
Этот специализированный механизм, по-видимому, специально обеспечивает иммунную систему точно настроенной стратегией для повышения эффективности важнейших секреторных эффекторных функций Т-лимфоцитов при минимизации неспецифической, опосредованной цитокинами стимуляции неспецифических клеток, уничтожения клеток-мишеней и гибели клеток, вызванной активацией. Молекулярные основания, участвующие в поляризованном секреторном движении к ИС в Т-лимфоцитах, были в центре внимания; таким образом, были разработаны разные модели и несколько стратегий визуализации, чтобы получить представление о механизмах, управляющих направленным секреторным трафиком. Несколько современных подходов к визуализации на основе живых клеток были разработаны для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе этого важного иммунного секреторного ответа.
Видео 1: Иммунный синапс и поляризация мультивезикулярных тел.
Наша лаборатория разработала протокол, который позволил нам визуализировать ранние стадии формирования ИС и последующий поляризованный секреторный трафик к ИС с использованием визуализации живых клеток (видео 1). Таким образом, мы заразили В-клетки Raji, покрытые суперантигеном стафилококкового энтеротоксина E, Т-клетками Jurkat. Это можно сделать в слайд-камерах µ-Slide на 8 лунок. Мануэль Искьердо, (Кафедра биохимии, Институт биомедицинских исследований им. Альберто Солса)
На видео выше представлена визуализация живых клеток (52 мин; 3 кадра в секунду), которая фиксирует образование двойного синапса между трансфицированной GFP-CdC63 клеткой Jurkat (зеленая) и двумя клетками Raji (синяя) и последующее поляризованное движение мультивезикулярных телец к областям синаптических контактов в клетке, образующей синапсы (в центре), но не в двух клетках Jurkat, которые не образуют синапсы (слева). Клетки визуализировали на 8-луночной слайд-камере µ-Slide ibidi.
Чтобы исследовать роль реорганизации F-актина в синаптической области во время формирования синапса, мы сравнили архитектуру актина в контрольных и PKC-дельта-интерферированных клонах Jurkat человека. Последующая фиксация и иммуномечение выявили истощение F-актина в центральной области синаптического интерфейса в контроле, но не в клоне с интерференцией P5 PKCdelta (видео 2). Этот результат приводит к заключению, что PKCдельта-зависимое удаление F-актина необходимо для эффективной секреции экзосом. Мануэль Искьердо, (Кафедра биохимии, Институт биомедицинских исследований им. Альберто Солса)
Видео 2: F-актиновая архитектура интерфейса иммунологических синапсов в клетках, подвергшихся вмешательству в PKCdelta.
На видео 2 представлена 3D Z-проекция фиксированных клеток Jurat (контроль, C3 и PKCdelta, P5), помеченных CMAC (синий) через 1 час после образования конъюгата синапса. F-актин визуализировали с помощью фаллоидина-488 (зеленый). Белые прямоугольники в кадре 1 соответствуют иммунологическому интерфейсу синапсов. Первая фотограмма видео соответствует виду синаптического конъюгата сверху, тогда как последний кадр показывает область иммунологического контакта синапса (синаптический интерфейс) под углом 90 градусов к наблюдателю. Верхние панели: слитые CMAC и фаллоидиновые каналы. Нижние панели: увеличенная область иммунологического синапса (увеличение в 1,5 и 2,5 раза для контрольной клетки (C3) и клетки PKCdelta (P5); белые прямоугольники на верхних панелях) фаллоидинового канала. Накопление F-актина в областях синаптических контактов (обведенных белыми прямоугольниками) очевидно в обеих клетках. Однако истощение F-актина в центральной области синаптического интерфейса наблюдается в контроле, но не в PKC-дельта-интерферированном P5, что визуализировалось, когда синаптический интерфейс находился под углом 90 градусов к наблюдателю на конец видео. Конфокальная визуализация и культивирование клеток проводилось на 8-луночной слайд-камере µ-Slide ibidi.
