Арт. 80209 / 80209-150
Рауль Пенья, PhD, IMIM, Барселона, Испания
Рак - больше, чем одно заболевание
Под эгидой рака скрывается более двухсот болезней, объединенных одной уникальной характеристикой: их способностью развиваться без остановки. Вы когда-нибудь задумывались, почему мыши маленькие, а слоны большие? В то время как разные животные имеют схожие типы клеток, в основном одинакового размера, у слона клеток на миллионы больше, чем у мыши. Например, эта разница достигается за счет того, что клетки печени мышей перестают делиться, когда весь орган достигает заданного размера. В случае печени слона сигнал к остановке достигает клеток позже, чем в печени мыши. Важный факт, который есть у них обоих, заключается в том, что они остановятся на заранее определенном размере, который коррелирует с размером этого вида.
Что произойдет, если клетки утратят способность прекращать деление? Может ли печень мыши стать такой же большой, как печень слона? На самом деле нет, но только представьте!
Что такое Рак?
Когда ваши клетки теряют способность контролировать рост (на который могут влиять многие факторы), это называется раком. Однако, чтобы быть более точным, научное и медицинское сообщество использует шесть различных общих характеристик для определения рака. Мы называем их Признаками Рака. Они определяют, следует ли классифицировать случайное заболевание как рак. Эти признаки сосредоточены на злокачественных клетках и на том, что происходит со здоровыми клетками, когда они поражаются болезнью, также известными как клетки микроокружения.
Цель исследования рака
Молекулярный механизм, контролирующий рост, называется ингибированием клеточного контакта. Клеточные биологи определяют этот процесс как остановку клеточного роста, когда клетки вступают в контакт друг с другом. Фактически, большинство классических фундаментальных исследований рака сосредоточено на том, как клетки могут обойти это контактное торможение и начать расти быстрее. Цель этого исследования очень проста для понимания: если вы определите молекулярный механизм, который отличает злокачественные раковые клетки от клеток здоровых тканей, вы сможете теоретически подавить его и, надеюсь, убить злокачественные клетки.
Прорывы и вызовы в исследованиях рака
Химиотерапия и многие методы лечения рака на основе антител основаны на этой стратегии. Канцерогенные агенты (например, табачный дым или асбест) и даже некоторые нормальные клеточные процессы (например, генерация активных форм кислорода как побочный продукт производства клеточной энергии) могут вызывать мутации в здоровых клетках, которые влияют на гены, участвующие в росте клеток. Исследователи смогли определить ключевые механизмы, которые регулируют возникновение и прогрессирование рака, сравнив геномы и белковые пути от раковых клеток к здоровым клеткам. Фактически, большинство раковых заболеваний сегодня излечимы или могут контролироваться с помощью комбинации хирургии и лекарств, которые могут ингибировать эти пути. В последние годы появились новые стратегии лечения в сочетании с медикаментозной терапией, направленные на укрепление собственной иммунной системы пациента путем ингибирования иммунного ухода раковых клеток. Теперь все больше и больше типов рака можно лечить с помощью эффективных (индивидуализированных) методов лечения.
К сожалению, все еще существуют виды рака, которые не поддаются успешному лечению, а это означает, что тысячи пациентов все еще борются с болезнью. Более того, когда больной пролечился и вылечился по определенной схеме, но позже у него случился рецидив, то химиотерапевтическое средство, которое применялось в первый раз, зачастую уже не подействует снова. На сегодняшний день не существует способов лечения метастазов, которые являются основной причиной смерти от рака. Несмотря на десятилетия успешных изучений рака, необходимы дальнейшие исследования. Фундаментальные исследования могут помочь определить новые механизмы, влияющие на регуляцию роста клеток. После того, как они будут выявлены, необходимы трансляционные исследования, чтобы эффективно применить эти открытия к пациентам, для которых еще нет эффективного лечения.
Ключевые клетки в развитии и прогрессировании рака
Белок называется Snail1, а механизм известен как эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). ЭМП заставляет эпителиальные клетки терять свою апикально-базальную полярность. Эта потеря полярности модулирует их цитоскелет, что заставляет их проявлять сниженные межклеточные адгезивные свойства. Фактически, в зависимости от степени перехода, эпителиальные клетки могут индивидуально или коллективно приобретать мезенхимальные черты, что, в свою очередь, увеличивает их подвижность и инвазивные способности.
В частности, в случае Snail1 экспрессия этого белка во многих эпителиальных раковых клетках приводит к полной ЭМП, которая затем увеличивает их способность отделяться от других клеток, а также их подвижность, их инвазивные способности и их химиорезистентность (наряду с другими характеристиками клетки). До сих пор ни одна фундаментальная исследовательская лаборатория не смогла определить конкретное лечение, которое могло бы эффективно блокировать либо экспрессию Snail1, либо перепрограммирование клеток, вызванное процессом ЭМП in vivo. Более того, как описано далее в этой статье, экспрессия Snail1 в некоторых типах неэпителиальных клеток, таких как фибробласты и эндотелиальные клетки, создает петли активации, которые ускоряют прогрессирование рака, метастазирование и резистентность к химиотерапии.
Методы исследования раковых клеток и открытие лекарств
Исследователи рака используют различные методы для изучения развития, прогрессирования и лечения рака. В нашей лаборатории, например, мы используем клеточные анализы в качестве первого шага в выявлении новых лекарств-кандидатов для лечения рака у пациентов. Типы раковых клеток и протоколы, используемые в этих клеточных анализах, развивались годами. Основные протоколы включают использование стандартных лабораторных линий раковых клеток. В сложных анализах используются раковые клетки, выделенные у конкретного пациента, или смесь раковых и нераковых клеток (например, стромальных клеток, фибробластов), которые присутствуют в опухоли. Раковые клетки можно выращивать непосредственно на пластиковой посуде для культивирования или, если кто-то хочет использовать более физиологический трехмерный подход, в определенных матрицах, которые напоминают те, что содержатся в опухоли пациента. В сложных анализах клеточная среда включает факторы роста, которые также можно обнаружить в микроокружении раковых клеток in vivo.
Эти анализы разработаны с целью быть экономически эффективными, быстрыми, простыми, продуктивными и в последнее время автоматизированными. По сути, цель состоит в том, чтобы культивировать клетки в присутствии набора соединений, чтобы выяснить, эффективно ли эти соединения убивают раковые клетки. Основная цель состоит в том, чтобы уменьшить выживаемость клеток в злокачественных раковых образованиях, снизить подвижность клеток, чтобы уменьшить метастатическую способность, или даже добиться полного перепрограммирования раковых клеток в неагрессивное состояние.
Перепрограммирование типа клеток может быть сложным процессом для проверки, поскольку обычно необходимы дорогостоящие технологии секвенирования. Подвижность клеток легче измерить при использовании автоматизированных систем и лабораторного оборудования (например, вставок ibidi Culture-Insert), которые делают анализы более воспроизводимыми и более легкими для количественной оценки. В настоящее время основной целью большинства клеточных анализов, предназначенных для выявления новых терапевтических препаратов, является уничтожение раковых клеток. Существуют различные протоколы для измерения выживаемости клеток. Окрашивание кристаллическим фиолетовым или МТТ обычно используется для обнаружения выживших клеток путем их фиксации и окрашивания необратимым красителем после обработки.
Другой альтернативой для проверки жизнеспособности клеток является использование флуоресцентных красителей для окрашивания живых клеток (рис. 1 и 2). Обычно эти соединения проницаемы для клеточной мембраны, и когда они локализуются в определенных органеллах (например, митохондриях, лизосомах, аппарате Гольджи, ядрах и ядрышках) или в любой клеточной мембране, они испускают флуоресценцию, которую можно отследить с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии. Список органелл-мишеней, которые можно визуализировать, огромен и растет с каждым годом.
Рисунок 1: Визуализация гибели клеток в клетках Hek293 после химиотерапевтического лечения с использованием флуоресцентных красителей для окрашивания in vivo. Клетки культивировали и визуализировали в планшете µ-Plate на 24 лунки. Акридиновый оранжевый использовался для окрашивания живых здоровых клеток (зеленый), а Hoechst использовался для окрашивания живых клеток (синий). Йодид пропидия (PI) использовали для окрашивания мертвых или умирающих клеток. Необработанные клетки Hek293 (A) не показывают умирающих клеток красным цветом, тогда как клетки Hek293, обработанные химиотерапевтическими агентами доксорубицином (B) или винбластином (C), демонстрируют резкое увеличение гибели клеток (красный цвет) через 72 часа. Конфокальная микроскопия на Leica TCS SP5.
Интересно, что в некоторых органеллах флуоресценция реагирует на их активность и жизнеспособность клеток, увеличивая интенсивность излучения или вызывая изменение цвета излучения красителя. Это позволяет исследователям внедрять автоматизированные системы для мониторинга эффектов лекарств. Однако системы визуализации требуют высококачественного лабораторного оборудования для обеспечения оптимального качества конечного изображения. Комбинация инвертированной конфокальной микроскопии и камер или планшетов для клеточных культур с прозрачным дном является современным решением для получения наилучших результатов визуализации, особенно при использовании объективов с увеличением 40x или 63x. Многолуночные планшеты ibidi с полимерным дном являются хорошей альтернативой стеклу, поскольку они сочетают в себе превосходную адгезию клеток с оптимальными свойствами визуализации. Эти планшеты для визуализации полностью плоские и имеют оптически идеальное дно из полимера толщиной, сравнимой с толщиной покровного стекла, что обеспечивает превосходные оптические характеристики даже при использовании объективов с большим увеличением и масла для визуализации клеток. Кроме того, черные полосы между лунками блокируют перекрестные помехи флуоресценции во время визуализации. Таким образом, 96-луночный планшет (µ-Plate 96 Well Black) является идеальным вариантом для одновременного тестирования многих соединений или одного и того же соединения в различных типах клеток.
Рисунок 2. Окрашивание митохондрий в клетках Hek293 после химиотерапевтического лечения, визуализированных и культивированных в 24-луночном планшете. MitoTracker Red CMXRos использовали для окрашивания здоровых митохондрий (красный), а Hoechst — для окрашивания ядер клеток (синий). В необработанных клетках Hek293 (A) наблюдается большое количество митохондрий, тогда как в клетках Hek293, обработанных химиотерапевтическими агентами паклитакселом (B) или винбластином (C), наблюдается резкое уменьшение митохондрий через 72 часа. Конфокальная микроскопия на Leica TCS SP5.
«Тем не менее, я предпочитаю использовать 24-луночный планшет (µ-Plate 24 Well Black) для изображения своих клеток. У них большая поверхность для посева и визуализации большего числа клеток! Это простой способ получить крутые результаты.» - Рауль Пенья (Рауль Пенья. Рауль получил степень бакалавра биологии и докторскую степень в Университете Страны Басков (Испания). После работы на нескольких должностях в Испанском национальном исследовательском совете (CSIC) в 2007 году он стал старшим заведующим лабораторией Антонио Гарсиа де Эррерос в Институте медицинских исследований в Маре (IMIM). Эта исследовательская группа занимается изучение роли Snail1, EMT и микроокружения опухоли в развитии рака.
Тем не менее, я предпочитаю использовать 24-луночный планшет (µ-Plate 24 Well Black) для визуализации своих клеток. У них большая поверхность для посева и визуализации большего числа клеток! Это простой способ получить крутые результаты. Raúl Peña
Наша лаборатория занимается активацией эндотелиальных клеток с помощью Snail1, которая способствует ангиогенезу и, следовательно, прогрессированию опухоли. Недавно группа начала фокусироваться на сосудистых опухолях как на новой модели для изучения биологии эндотелиальных опухолей. В нашей лаборатории клеточные анализы были, есть и продолжают оставаться начальным этапом для многих трансляционных исследовательских проектов, которые включают использование экспрессирующих Snail1 эпителиальных, фибробластных или эндотелиальных клеток. 96-луночный планшет µ-Plate Black позволяет нам сначала выполнить высокопроизводительный анализ жизнеспособности клеток с использованием до 30 различных молекул-кандидатов в трех экземплярах одновременно. Затем мы используем µ-Plate 24 Well Black для детальной проверки и визуализации выбранных кандидатов. Когда идентифицируется образец, который снижает жизнеспособность, активность или миграцию раковых клеток, требуются дальнейшие исследования in vitro для описания и характеристики лежащего в его основе механизма действия. Наконец, обширные эксперименты на животных in vivo и ex vivo используются для подтверждения способности кандидата блокировать рост опухоли.
Но это история уже для другой статьи…
