Визуализация живых клеток: 5 советов по подготовке первичных клеток периферической нервной системы к визуализации

11 Марта 2022 17:09

// Лабораторная посуда

Визуализация живых клеток является одним из самых увлекательных современных методов работы с клеточными культурами. В данной статье Флавия Миллези, сотрудник лаборатории профессора Кристины Радтке Венского медицинского университета, делится своим опытом и опытом своих коллег по работе с живыми клетками.

Флавия Миллези, Венский медицинский университет

Визуализация живых клеток не только позволяет нам получать снимки клеток, как и другие методы визуализации, но, в конечном счете, является для нас единственным способом увидеть клетки "в действии". Чтобы понять, как они двигаются и мигрируют, как они взаимодействуют, как они делятся и секретируют, фагоцитируют и питаются. Визуализация живых клеток помогает нам понять биологические процессы. Но, как и в других методах, при визуализации живых клеток необходимо учитывать некоторые моменты, начиная с параметров клеточной культуры и заканчивая техническими аспектами и методами анализа данных. Команда лаборатории профессора Кристины Радтке из Венского медицинского университета использует визуализацию живых клеток с самого начала своих исследований в Вене.

Мы используем этот метод для исследования взаимодействий между клетками периферической нервной системы, такими как нервные клетки, клетки Шванна, фибробласты нейронов и различными биоматериалами, используемыми для реконструкции тканей. Поскольку время является критическим фактором в регенерации нервов, мы особенно заинтересованы в усилении миграционного потенциала шванновских клеток, которым необходимо быстро достигать места повреждения и соединять его, чтобы направлять регенерирующие аксоны. Я настоятельно рекомендую всем, кто интересуется поведением и процессами клеток, использовать визуализацию живых клеток для своих исследований. Ниже несколько советов от меня и моих коллег, которые помогут вам начать знакомство со своими клетками на совершенно новом уровне.Флавия Миллези, Венский медицинский университет

1. Убедитесь, что у вас есть подходящая посуда для культивирования клеток

Прежде всего, вам нужно решить, какие элементы имеют значение, что вы хотите визуализировать. Вы просто хотите визуализировать миграцию ваших клеток? Или вы хотите выяснить, меняют ли ваши клетки направление миграции, например, на определенный фактор роста? Для визуализации живых клеток доступно большое разнообразие посуды для культивирования клеток, и, в частности, компания ibidi предлагает различные варианты, идеально подходящие для ваших нужд. Например, слайд-камеры µ-Slide для хемотаксиса (рис. 1) позволяют измерять хемотаксис в реальном времени и предоставляют собой камеру для клеток, в которую можно добавлять различные факторы. Клетки высевают посередине между камерами, и можно проанализировать, в какую сторону предпочтительно мигрируют клетки. По большей части мы используем слайд-камеры µ-Slide на 4 лунки для наших экспериментов по визуализации живых клеток, поскольку их большая площадь позволяет наблюдать несколько положений в одной лунке. Другим вариантом является µ-Slide 4 Well Ph+ (Слайд-камера µ-Slide, 4 лунки, для фазово-контрастной микроскопии) со специальным промежуточной пластиной для превосходной фазово-контрастной и высококачественной флуоресцентной микроскопии. Доступно множество различных моделей камер, многие из которых мы еще не пробовали, но обязательно будем в будущем.

Рис .1 Схема слайд-камеры µ-Slide ibidi для хемотаксиса

2. Все о клетках: тщательно спланируйте подготовку проб

Далее важно подумать о том, как подготовить клетки. В зависимости от того, какой тип клеток, как быстро они движутся и как быстро их количество увеличивается, необходимо определить различные параметры. Шванновским клеткам, например, требуется некоторое время, чтобы осесть, поэтому имеет смысл начинать эксперименты по визуализации живых клеток через несколько часов после посева. Более того, на некоторые клетки, как правило, влияет межклеточный контакт, поэтому важно думать о правильном числе посева клеток в зависимости от того, что исследуется. Наконец, также важно решить, требуется ли дополнительное покрытие.

3. Поддерживайте комфортную среду для клеток под микроскопом

Как только клетки будут готовы, можно идти к микроскопу. К сожалению, не все микроскопы можно использовать для визуализации живых клеток. Важно, чтобы они были оснащены встроенным инкубатором, регулирующим количество CO₂ и температуру, чтобы клетки оставались живыми. Мы используем Olympus IX83 в сочетании с инкубационной системой ibidi Stage Top (см. рис. 2). Она предлагает нам точный контроль температуры и CO₂, а также влажности. Мы обычно проводим наши эксперименты по визуализации живых клеток при постоянной температуре 37°C, 5% CO₂ и 50% влажности. Доступны две разные пластины с подогревом: одна для предметного стекла с одной камерой, а другая — для одновременного изображения предметных стекол из четырех камер. Система идеально подходит для разнообразных экспериментов.

Рис.2 Система инкубации ibidi Stage

4. Выберите подходящие параметры микроскопии и записи

Как только слайд-камеры закреплены в пластине под нагретой крышкой, мы можем начать эксперимент. Важно учитывать увеличение микроскопа, как часто система должна делать снимки и как долго. Например, поскольку шванновские клетки являются быстро движущимися клетками, имеет смысл использовать меньшее увеличение, чем для фибробластов, которые двигаются гораздо медленнее и мигрируют на более короткие расстояния. Мы используем программное обеспечение CellSens Olympus Corporation, чтобы делать снимки каждые десять минут в течение не менее 10 часов, что является удобными настройками для экспериментов по миграции. Если вас интересует, как движутся клетки, или даже что-то совершенно другое, например, как клетки поглощают частицы, возможно, имеет смысл сократить время между снимками.

5. Оцените свой эксперимент, проанализировав данные

После завершения эксперимента программа, в нашем случае, предоставляет нам файлы .vsi, которые мы обычно конвертируем в видео .avi и последовательности изображений .tiff. Затем, используя ImageJ, мы отслеживаем выбранные ячейки с помощью плагина Manual Tracking, отслеживая и нажимая на отдельные клетки в каждом кадре. Это приводит к индивидуальному пути миграции для каждой клетки. После этого оцените результаты с помощью бесплатного ПО от ibidi Chemotaxis and Migration Tool, который позволяет рассчитать среднюю скорость, среднее общее и евклидово (эффективное) расстояние, а также индекс направленности для каждой клетки (см. рисунок 3).