Арт. 80469
Дерек Сунг, Медицинский факультет Пенсильванского университета
Модель царапины
При использовании модели царапины ученые кончиком пипетки делают «царапину» монослоя клеток в многолуночном планшете и наблюдают, сколько времени требуется для затягивания разрыва (данные тесты также называют анализами «закрытия ран» или «заживления ран»). Этот тип эксперимента позволяет анализировать миграцию клеток и может быть дополнен различными лекарствами и химическими веществами для выяснения конкретных механизмов.
Эндотелиальные клетки, культивированные в чашке Петри ibidi диаметром 35 мм с 2-луночной культуральной вставкой. Клеткам давали возможность мигрировать в течение 24 часов после удаления вставки, затем фиксировали в 4% PFA и пермеабилизировали. Клетки окрашивали антителами против VE-кадгерина (пурпурный), фаллоидином для F-актина (зеленый) и DAPI для ядер (синий), а затем визуализировали методом конфокальной микроскопии.
Использование кончика пипетки для создания промежутка между клетками сопряжено с некоторыми проблемами, в числе которых низкая точность и плохая воспроизводимость результатов. Для решения данных проблем компания ibidi предлагает силиконовые вставки с лунками, которые позволяют формировать промежутки четко определенной ширины. Для заказа доступны вставки интегрированные в посуду или наборы вставок для установки пользователем в посуду самостоятельно.
Сколько себя помню, я выполнял тесты с "царапинами". Как и в большинстве анализов in vitro, одинаковость процедуры является ключом к достижению точных и воспроизводимых результатов. Как человек, который проводил этот эксперимент бесчисленное количество раз, отмечу, что использование пипетки для создания зазора в ручную имеет несколько ключевых проблем, которые доставляли мне неудобство в прошлом. Вот почему знакомство с культурными вставками от ibidi стало чем-то вроде спасения. Культуральные вставки ibidi имеют много преимуществ по сравнению с традиционными методами анализа с царапинами Дерек Сунг (Доктор медицинских наук в Медицинской школе Университета Пенсильвании)
Преимущества культуральных вставок ibidi
1. Постоянная ширина зазора
Одной из самых больших проблем при традиционном анализе методом "царапания" и использовании пипетки для ручного царапания центра лунки, чтобы избавиться от клеток, является несоответствие расстояния между зазорами в разных экспериментах. Более того, сама царапина часто не прямая. В результате начальное расстояние часто может варьироваться от десятков до сотен микрон. Культуральные вставки компании ibidi - изготовленные из силикона вкладыши с лунками, расстояние между которыми 500 мм. Это гарантирует, что зазор будет прямым, а расстояние будет постоянным каждый раз.
2. Четкая граница между клетками и областью "раны"
Царапина, сделанная вручную, также создает проблему свободно плавающих клеток, которые не были полностью удалены. Эти свободно плавающие клетки могут влиять на скорость миграции, задерживая миграцию края клеток, высвобождая внутриклеточное содержимое или повторно прикрепляясь. Вставки ibidi являются съемными и оставляют после себя четкие и чистые границы раны и прямые мигрирующие края.
3. Минимальное количество клеток
Традиционные тесты методом "царапины" проводятся в многолуночных планшетах и требуют сплошного слоя клеток. Если в эксперименте используется несколько типов условий (медикаментозное лечение или манипуляция с генами) и требуется несколько повторений, это может быстро привести к большому количеству клеток. Эти эксперименты могут стать трудными для проведения с редкими или дорогими клетками (такими как первичные клетки, выделенные из труднодоступной ткани). Культуральные вставки ibidi имеют небольшую площадь роста, чтобы свести к минимуму количество клеток, необходимое для эксперимента (0,22 см² на лунку, если быть точным). Это позволяет максимально эффективно использовать драгоценные клетки и/или увеличивает количество повторений.
4. Чашки с тонким дном
Скретч-анализы обычно проводят в многолуночных планшетах с толстым полистироловым дном, которые позволяют визуализацию только в светлом поле и количественную оценку расстояния зазора. Культуральные вставки, интегрированные в посуду ibidi, устанавливаются на дно толщиной сопоставимой с толщиной покровного стекла, обработанное для тканевых культур и стерилизованное. Это позволяет проводить светлопольную и иммунофлуоресцентную визуализацию. Как считает Дерек Сунг (Доктор медицинских наук в Медицинской школе Университета Пенсильвании), это лучший аспект данного продукта, который позволил ему изучать такие структуры, как цитоскелет, морфологию межклеточной адгезии, морфологию ядра и многое другое. Кроме того, как отмечает Дерек Сунг, это дает возможность просмотреть на клетки на переднем крае и сравнить их с отстающими клетками. Возможности визуализации в разных режимах в конечном счете максимизируют объем данных от одного эксперимента, экономя на затратах и реагентах.
5. Индивидуальные вставки для отдельных экспериментов
«Эффект края» относится к феномену клеточной культуры, когда лунки на внешнем периметре многолуночного планшета подвергаются большему испарению, чем внутренние лунки, что приводит к различным условиям и потенциально противоречивым результатам. Аналогичные эффекты можно наблюдать при проведении анализа методом царапин с использованием многолуночных планшетов, что влияет на согласованность и воспроизводимость результатов. Культуральные вставки ibidi доступны для заказа в формате одиночных элементов, интегрированных в чашки Петри. Это предотвращает любые «краевые эффекты». Плюсом является то, что чашки Петри ibidi имеют функцию блокировки крышки, чтобы крышка оставалась на месте во время работы с посудой.
