Арт. Sequential fluid injection pack
Электрохимические иммуноанализы
Иммуноанализы широко применяются в диагностике, а также в анализе окружающей среды и пищевых продуктов. Они основаны на способности специфических антител захватывать целевые молекулы-анализируемые вещества (аналиты). Рост доступности таких селективных антител на рынке позволяет определять широкий спектр аналитов. Ключевым шагом на пути к созданию мобильных, автономных и непрерывно работающих иммуносенсоров является эффективная интеграция анализа в соответствующую платформу. Главная задача — добиться надёжности, устойчивости и бесшовной интеграции. С этой целью в качестве основы была выбрана микрофлюидная система. Такой подход минимизирует ручные операции и расход реагентов, а также позволяет создавать компактные устройства с точным контролем физико-химических реакций.
Целью работы стало создание полной проточной системы на базе микрофлюидной проточной ячейки для автоматического определения TMB (тетраметилбензидина) — одного из самых распространённых субстратов иммуноанализов — методом хроноамперометрии (CA). Эта система обеспечивает автоматическое и непрерывное измерение, продвигая переход от лабораторных анализов к иммуносенсорам.
В исследовании в качестве примера использовалось детектирование диклофенака, включающее три основных этапа:
1. Конкуренция в пробе
Готовится раствор, содержащий пробу диклофенака, антитела, меченные HRP, и магнитные частицы с диклофенаком. Молекулы диклофенака конкурируют с частицами за связывание с антителами. Чем выше концентрация диклофенака, тем меньше антител связывается с частицами. Этот этап позволяет исключить помехи, так как только диклофенак обладает аффинностью к определённым антителам.
2. Преобразование TMB
Магнитные частицы отделяются, а белок HRP, связанный с антителами, превращает субстрат TMB в его окисленную форму — электрохимический маркер. Наличие перекиси водорода в среде восстанавливает активность HRP, позволяя ему многократно окислять TMB, усиливая сигнал.
3. Количественное определение окисленного TMB
Полученный раствор с окисленным TMB вводится в микрофлюидную систему, где подвергается хроноамперометрическому анализу. Измеряется электрохимический отклик, который обратно пропорционален концентрации диклофенака в изначальной пробе. Именно эта точная стадия измерения и является фокусом описанной микрофлюидной системы.
Разработка микрофлюидной системы
Команда разработала микрофлюидную систему с управлением потоком, автоматическими клапанами и усовершенствованным дизайном чипа с экранированными электродами (SPE) и мини-потенциостатом, что позволяет выполнять хроноамперометрию и способствует переходу к иммуносенсорам.
Что такое хроноамперометрия?
Хроноамперометрия — это электрохимический метод, при котором на ячейку подаётся постоянное напряжение, а измеряется текущий во времени ток. Метод используется для изучения окислительно-восстановительных реакций и определения концентраций веществ в растворе. Он отличается высокой чувствительностью при низкой стоимости, что позволяет миниатюризацию сенсоров.
Экспериментальная установка
Растворы субстратов из иммуноанализов вводились в микрофлюидное устройство с помощью контроллера давления (OB1 MK3+, Elveflow), обеспечивающего стабильный поток и сигналы. Сжатый воздух из резервуаров приводил жидкости в движение через клапаны, чип и соединительные трубки.
- Трёхходовой клапан обеспечивал быструю промывку трубок.
- 12-канальный клапан позволял последовательную подачу образцов.
- Датчик потока отслеживал поток с помощью обратной связи с контроллером давления.
- Пузыреуловитель устранял воздушные пузырьки.
- Потенциостат с электродом SPE помещался в проточную ячейку из PDMS и защищался клеткой Фарадея.
Экспериментальная установка. Условные обозначения: A – блок управления с программным обеспечением ESI, B – источник давления, C – контроллер потока OB1, D – резервуары, E – направляющий клапан 12:1 (Mux Distribution Valve), F – трёхходовой байпасный клапан, G – микрофлюидный резистор, H – датчик расхода MFS, I – ловушка пузырьков, J – клетка Фарадея, K – потенциостат, L – микрофлюидный чип с напечатанным на экране электродом (SPE), M – резервуар для отходов, N – Mux Wire (контроллер микрофлюидных клапанов), O – коллектор.
Рисунок 1. Схематическое изображение микрофлюидной установки для электрохимических измерений на экранированном электроде (SPE). Условные обозначения: A – блок управления с программным обеспечением ESI, B – источник давления, C – контроллер потока OB1, D – резервуары, E – направляющий клапан 12:1 (Mux Distribution Valve), F – трёхходовой байпасный клапан, G – микрофлюидный резистор, H – датчик расхода MFS, I – ловушка пузырьков, J – клетка Фарадея, K – потенциостат, L – микрофлюидный чип с экранированным электродом (SPE), M – резервуар для отходов. Зелёные линии обозначают соединения сжатого воздуха, синие – жидкостные шланги, красные стрелки – линии передачи данных.
Изготовление проточной микрофлюидной ячейки
Для создания проточной ячейки из PDMS (см. Рис. 2) использовалась технология 3D-печати (Ultimaker 2, ABS-пластик). Внутренняя структура растворялась ацетоном, создавая каналы, которые затем соединялись с элементом SPE методом плазменной активации.
Рисунок 2: a) 3D-модель внутренней структуры микрофлюидного чипа: камера, входной канал (в центре) и выходные каналы (по краям камеры) были напечатаны отдельно для последующей сборки; b) готовый каркас из АБС-пластика, собранный из отдельных компонентов; c) полученный 3D-микрофлюидный чип с камерой проточной ячейки, совмещённой с электродом, и каналами для подключения входа и выхода.
Основные результаты
Количественное определение TMB
TMB, окисленный HRP, количественно определялся с помощью его восстановления методом хроноамперометрии. Оптимальный фоновый ток был при напряжении 330 мВ против Ag/AgCl, обеспечивая высокое соотношение сигнал/шум (SNR) и чувствительность.
Оптимизация конструкции ячейки
В отличие от громоздких макроскопических проточных ячеек, микрофлюидная ячейка потребляет меньше реагентов (примерно 100–300 мкл на пробу) и позволяет получать интенсивные сигналы за короткое время.
Трёхмерная архитектура чипа
Для достижения точного контроля потока была разработана 3D-архитектура чипа с центральным впускным каналом и четырьмя выходами. Вертикальный впуск улучшал удаление пузырей и обеспечивал стабильность потока (500–600 мкл/мин), при этом каждая проба занимала лишь 250 мкл и анализировалась за 30 секунд.
Тестирование MBBA-анализом
Система тестировалась на иммуноанализе с магнитными частицами и антителами к диклофенаку. После связывания и отделения сигнал усиливался благодаря регенерации HRP. Повышение скорости потока увеличивало интенсивность сигнала до оптимума (500 мкл/мин), после чего начинались потери из-за пузырей.
Рисунок 3: Влияние скорости потока на величину тока: a) временные зависимости (в логарифмическом масштабе) сигнала тока после введения 250 мкл окисленного раствора TMB и буфера (по три повторения для каждой скорости потока; светлая область отражает стандартное отклонение); b) рассчитанные отношения сигнал/шум в зависимости от соответствующих скоростей потока.
Воспроизводимость и калибровка
Система показала отличную воспроизводимость при повторных измерениях. Калибровочные кривые системы с электрохимическим детектированием и оптическим методом показали сходные значения IC50 (6.2 и 7.1 мкг/л соответственно). При этом SNR у электрохимической системы составило 60 против 19 у оптической, обеспечивая более быструю и чувствительную диагностику.
Рисунок 4: a) Временная зависимость (в логарифмическом масштабе) тока при последовательном введении восьми различных субстратных растворов из DCF-MBBA с разной концентрацией DCF (U = 330 мВ относительно Ag/AgCl, Q = 500 мкл/мин; светлая область соответствует стандартному отклонению). b) График пиковых значений тока в зависимости от концентрации калибраторов DCF и сравнение с калибровочной кривой, полученной методом оптического детектирования.
Заключение
Разработана полностью интегрированная микрофлюидная система для определения TMB методом хроноамперометрии — самого распространённого субстрата в ИФА. Система обеспечивает точную подачу жидкости и считывание сигналов с помощью оборудования Elveflow, достигая высокой чувствительности и минимального времени анализа. Благодаря 3D-печатному чипу время измерения сократилось до 30 секунд при высоком SNR (60). Это важный шаг в сторону перехода от традиционного иммуноанализа к автономным иммуносенсорам и высокопроизводительным системам анализа.
