Арт. AFM-HA-70-4500
Аннотация
Исследование «Структурная гибкость и кинетика дезинтеграции отдельных молекул ферритина» изучает динамическое поведение ферритина на уровне одной молекулы. Используя оптический нанопинцет, исследователи наблюдали, как структура ферритина реагирует на изменения окружающей среды, такие как колебания pH и концентрации аскорбиновой кислоты. Основные результаты исследования включают увеличение динамики ферритина под действием аскорбиновой кислоты, что приводит к растворению ферритного ядра, и путь разборки ферритина при pH 2, выявляющий промежуточные фрагменты в ходе этого процесса. Это исследование способствует пониманию роли ферритина в метаболизме железа и потенциальному применению в медицине.
Контекст
Ферритин, сферическая белковая оболочка, состоящая из 24 субъединиц, служит эффективной системой хранения и высвобождения железа через свои каналы. Изучение изменения структуры ферритина в ответ на воздействие различных химических веществ необходимо для понимания происхождения заболеваний, связанных с железом, у человека и других организмов. В настоящее время наши представления о ферритине основаны в основном на ансамблевых измерениях, которые дают лишь усредненный ответ популяции белков. Влияние химических веществ на динамику ферритина и высвобождение железа практически не изучено на уровне отдельных белков.
Цель исследования
В данном исследовании используются передовые оптические нанопинцеты и микрофлюидика, а также техника без меток, позволяющая наблюдать за гибкостью и динамикой отдельных молекул ферритина в режиме реального времени. Цель состоит в том, чтобы проследить за конформационными изменениями этих молекул в ответ на такие факторы окружающей среды, как изменение pH и концентрации лигандов.
Установка для эксперимента
Материалы
- Поворотный двунаправленный микрофлюидный клапан (распределительный клапан MUX, Elveflow)
- Электромагнитный клапан с контроллером клапана (MUX, Elveflow)
- Датчик скорости потока (MFS-D-4, Elveflow)
- Микрофлюидный программируемый шприцевой насос (11 Elite, Harvard Apparatus)
- Модульная оптическая пинцетная система (OTKB, Thorlabs)
- Лазерный диод с контроллером (852 нм, Thorlabs)
- Si лавинный фотодетектор (APD130A, Thorlabs)
Метод исследования
Рисунок 1 - Схема установки оптического нанопинцета. Правая врезка: изображение сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) структуры DNH в золотой пленке толщиной 100 нм, полученное под углом 20° над плоскостью. Copyright Ref Nano Lett. 2023, 23, 8, 3251-3258
В данной работе используется оптический нанопинцет для отслеживания и анализа динамического поведения отдельных молекул ферритина. Как показано на рис. 1, лазер с длиной волны 852 нм фокусируется на золотой структуре с двумя наноотверстиями (DNH) с помощью безимерсионного объектива 60х с числовой апертурой (NA) 0.85. DNH располагается в специализированной проточной кювете с высотой канала 50 мкм.
Структура DNH создает плотное оптическое поле, оказывая оптическую градиентную силу, которая удерживает один белок в наноотверстии в течение длительного времени (правая вставка на рис. 2). Интенсивность света, проходящего через DNH, регистрируется кремниевым лавинным фотодиодом (APD) и преобразуется в сигнал напряжения. Из-за более высокого показателя преломления белка по сравнению с водой, захват белка приводит к увеличению пропускания, эффект известен как диэлектрическая нагрузка (рис. 2).
Рисунок 2 - Трасса пропускания для голоферритина, захваченного в структуру DNH, с T0 в качестве базовой линии пустого DNH. Правая вставка иллюстрирует образец DNH с молекулой ферритина, захваченной в зазор. Copyright Ref Nano Lett. 2023, 23, 8, 3251-3258
Микрофлюидная система состоит из,
- Шприцевой насос (Harvard Apparatus), который управляет скоростью и направлением потока
- Контроллер 3-ходового клапана и поворотный двунаправленный микрофлюидный клапан (распределительный клапан MUX, Elveflow).
- Датчик скорости потока (MSF, Elveflow) для контроля общего потока.
После захвата белка в камеру последовательно вводятся буферы с различной концентрацией аскорбиновой кислоты или различными уровнями pH при скорости потока 0,005 мл/мин.
Основные выводы
Исследование дает детальное представление о структурной гибкости ферритина и кинетике его разборки на уровне одной молекулы. Основные результаты включают:
Динамическая реакция на аскорбиновую кислоту
Различные восстановители, такие как аскорбиновая кислота (АК), помогают мобилизовать железо из ферритиновой оболочки через определенные каналы. Пациенты с гемохроматозом, у которых наблюдается значительная перегрузка железом, часто нуждаются в добавлении аскорбата во время хелатной терапии из-за низкого уровня аскорбата. Однако высокие уровни аскорбата могут повреждать белки, липиды и ДНК, генерируя радикалы в результате реакции Фентона. В связи с этим понимание влияния АА на конформацию ферритина необходимо для лучшего понимания этих патологий.
Увеличение концентрации AA ускоряет восстановление Fe³⁺ до Fe²⁺, что приводит к частым перемещениям 3-кратных каналов на ферритине. Такая активность каналов увеличивает гибкость молекул ферритина, что приводит к увеличению шума в оптическом сигнале, как показано на рисунке 3. Этот шум, количественно выраженный как среднеквадратичное значение (СКЗ), увеличивается с ростом концентрации АА и достигает максимума при 5 мМ АА (правая вставка рисунка 3).
Рисунок 3 - Введение аскорбиновой кислоты (AA) в захваченный голо-ферритин (с железным ядром) приводит к 3-кратному открытию канала, увеличивая гибкость белка, о чем свидетельствует увеличение шума. Правые квадратные диаграммы показывают нормированный среднеквадратичный коэффициент (СКК) пропускания при различных концентрациях АА.
Дезинтеграция в кислых условиях
Кроме того, высокая концентрация аскорбата может создавать кислую среду, влияющую на динамику ферритина и высвобождение железа, поскольку ферритин дезинтегрируется при очень низких уровнях pH. Однако эта конформационная модификация очень динамична, поскольку известно, что дезинтегррованный ферритин может вновь собираться при более высоком pH благодаря электростатическим взаимодействиям.
В этом контексте дезинтеграция ферритина наблюдалась при pH 2, о чем свидетельствовало поэтапное снижение сигнала передачи. С помощью оптического нанопинцета отслеживается кинетика дезинтеграции отдельных молекул ферритина, при этом сигнал передачи линейно коррелирует с объемом захваченного белка. Изначально нативный ферритин, состоящий из 24 субъединиц, демонстрирует высокий уровень пропускания. При воздействии pH 2 протонирование водородных связей между субъединицами приводит к дезинтеграции белка, что приводит к низкому уровню пропускания, соответствующему размеру фрагмента. Процесс разборки, показанный на рисунке 4, выявил четыре критических промежуточных фрагмента: 22-мер, 12-мер, тетрамер и димер.
Рисунок 4 - Кинетика распада одной молекулы ферритина на субъединицы. Трансмиссионная трассировка с несколькими каплями, демонстрирующая полную разборку одной молекулы ферритина при воздействии рН 2,0. Copyright Ref ACS Nano 2024, 18, 24, 15617-15626
Заключение
Данное исследование демонстрирует возможности оптических нанопинцетов и микрофлюидики для определения структурной гибкости и пути распада отдельных молекул ферритина. Понимание конформационных изменений ферритина в ответ на воздействие различных химических веществ имеет решающее значение для выяснения их роли в метаболизме железа, что облегчит разработку методов лечения заболеваний, связанных с железом. Полученные в ходе исследования одномолекулярные данные могут также вдохновить на дальнейшую разработку структур ферритина, в том числе на создание молекулярных машин и платформ для доставки лекарств. Исследование подчеркивает захватывающий потенциал этого инновационного подхода для изучения ферритина и его взаимодействий на беспрецедентном уровне детализации. Благодаря точности и контролю передовых микрофлюидных инструментов Elveflow, эта работа подчеркивает роль Elveflow как ведущего партнера в области научных открытий, позволяя исследователям расширять границы молекулярных исследований и углублять наше понимание применения микрофлюидных технологий.
