Исследование межклеточных взаимодействий в микрофлюидных чипах

Введение

Микрофлюидный чип (Fluidic 688) для межклеточных взаимодействий позволяет совместно культивировать различные типы клеток в отдельных, но взаимосвязанных камерах. Совместное культивирование различных типов клеток является важным шагом на пути к повышению физиологической релевантности для in vitro моделей физиологии и болезней. Сети сосудов соединяют все системы органов, транспортируя биомолекулы из одного места в другое, передавая сигнальные каскады, участвуя в экспрессии и регуляции генов, гомеостазе тканей, иммунном ответе и прогрессировании заболеваний.

В приведенном протоколе компания Elveflow, производитель оборудрвания для микрофлюидики, описывает, как заполнить отдельные камеры миколфлюидного чипа Fluidic 688 различными типами клеток и контролировать скорость потока через чип для динамической среды культивирования клеток. Клетки предварительно окрашены, чтобы проиллюстрировать закономерности разделения клеток в двух камерах во время посева.

Возможные применения

Совместное культивирование различных типов клеток в соединенных между собой камерах можно использовать для изучения:

Растворимого фактора:

• кондиционирование среды в камере B с помощью факторов, секретируемых клетками в камере A;
• "секретом" клеток – факторы роста, цитокины, хемокины;
• модели васкуляризации опухолей;
• молекулярные градиенты для анализов хемотаксиса и миграции клеток;
• иммунный ответ и заживление ран.

Совокупности нескольких органов:

• Модели нескольких органов на чипе;
• фаромокинетическое/ фармодинамическое тестирование лекарств (ADMET – абсорбция лекарств, распределение, метаболизм, экскреция, токсичность).

Физиологически значимых масштабов расстояний:

• системы клеточных сигналов и взаимодействие клеток на расстоянии.

Микрофлюидная установка для исследования межклеточных взаимодействий

Контроллер потока OB1

Детектор скорости потока

Трубки, фитинги и резервуары

Ловушка для пузырьков

Микрофлюидный чип Fluidic 688

Оборудование: - Контроллер потока OB1 с как минимум 1 каналом (0/2000 мбар); - Детектор скорости MFS3 (2.4-80 мкл/мин); - Система удаления пузырьков; - Стартовый набор фитингов с фиксаторов Люэра; - Емкость Falcon на 15 мл; - Микрофлюидный чип (Fluidic 688 с набором мини-соединений типа Люэр и силиконовыми трубками от microfluidic ChipShop); - Водяная баня с подогревом; - CO2 инкубатор; - Микроскоп.

Реагенты: - Клетки типа 1: MCF7 (3×106 клеток/мл) - Клетки типа 2: HEK293 (3×106 клеток/мл) - Среда: DMEM высоким содержанием глюкозы (c фетальной бычьей сывороткой, 10%; пенициллин/ стрептомицин, 100 ед./мл; 100 мкг/мл); - Буферы / красители: PBS / красители клеток (Calcein AM, 2 мкM; Hoechst 33342, 10 мкг/мл).

Конструкция микрофлюидных чипов для исследования межклеточных взаимодействий

Микрофлюидный чип для исследования взаимодействия клеток обеспечивает поток различных жидкостей через набор двойных портов на каждом конце чипа (2 и 3; 4 и 5). Варианты управления потоком для нескольких жидкостей включают (i) дублирование конфигурации, описанной ниже, (ii) добавление гидрораспределителя MUX для управления переключением между n x 12 различными жидкостями и (iii) добавление клапана для закачки небольших объемов реагента.

Геометрические характеристики

Две камеры объемом 37.8 мкл; шесть портов Mini Luer, по три на каждом конце, в том числе два, подключенных к длинным каналам для первоначального заполнения / посева (1 и 6), и четыре, подключенных к коротким каналам для проточной среды или ввода реагентов.

Характеристики чипа

Параметры	Значения
Тип интерфейса	Mini Luer
Объем камеры	37.8 мкл
Глубина камеры	400 мкм
Толщина крышки	125 мкм
Материал	PS
Обработка поверхности	Гидрофилизированная

Подготовка чипа

Обработка поверхности: «гидрофилизация» способствует прикреплению клеток к поверхности чипа (аналогично оборудованию для культивирования клеток, "обработанному тканевой культурой"). Для прикрепления клеток не требуется дополнительной обработки поверхности, хотя дополнительное покрытие может помочь в зависимости от типа клеток.

Работа с чипом: чип можно закрепить в чашке Петри, чтобы обеспечить стабильность при подсоединении трубок.

Разъемы: Порты Mini Luer подходят для микрофлюидных мини-люэровских разъемов и вилок ChipShop. Трубку (внешний диаметр 1/16 дюйма) можно присоединить к разъемам Mini Luer через короткую силиконовую муфту.

Краткое руководство по настройке микрофлюидной установки

Подготовка клеток

Следуя стандартным протоколам: Трипсинизируйте клетки из колбы для культивирования. Удалите трипсин. Тщательно подсчитайте и подготовьте исходную суспензию 3 × 10⁶ клеток / мл для посева.

Совет: Стремитесь к заселенности на уровне >70% во время посева и сливающемуся монослою перед перфузией.

Общая процедура заполнения жидкостью

• Чтобы заполнить камеру A, надежно закройте все порты на противоположном конце чипа (т.е. 4–6) заглушками Mini Luer. Это похоже на блокировку конца пустой соломинки пальцем перед тем, как вставить ее в напиток. Воздух останется на месте и предотвратит заполнение камеры B жидкостью.
• Заполните камеру A через порт 1 с помощью пипетки (опция: рассмотрите возможность использования адаптера для пипеток Mini Luer) или с помощью контроллера давления. Оба порта 2 и 3 можно оставить открытыми. При использовании наконечника пипетки убедитесь, что он вставлен перпендикулярно в порт Mini Luer.
• После заполнения аккуратно откройте порт 6, затем закройте порты 1–3 заглушками Mini Luer.
• Чтобы заполнить камеру B, осторожно снимите заглушки с портов 4 и 5.

Совет: Важно очень осторожно вставлять и извлекать заглушки Mini Luer, чтобы минимально нарушить поток жидкости в противоположной камере.

• Заполните камеру B через впускное отверстие 6.

Посев клеток в чипе

• Следуя общей процедуре заполнения жидкостью: заполните камеру A клетками типа A (маточный раствор 3 x10⁶ клеток / мл, ~ 113 400 клеток на камеру) и камеру B клетками типа B (маточный раствор 3 x10⁶ клеток / мл). После каждого добавления клеток проверяйте поток клеток в канал с помощью микроскопа.

Совет: Поместите чип в инкубатор на 30-60 минут между посевами камер A и B, чтобы уменьшить вероятность межкамерного перемешивания, то есть после посева клеток в камере A инкубируйте чип 30-60 минут, затем осуществите посев в камере B.

• Поместите микрофлюидный чип в CO₂ инкубатор на 6 – 24 часа, чтобы клетки прикрепились в статических условиях.

Совет: Чтобы канал не высыхал, осторожно закройте все порты, чтобы свести к минимуму испарение, поместите чип в чашку Петри вместе с небольшим резервуаром с водой, например, крышка пробирки на 50 мл и накройте.

• Осторожно меняйте среду вручную с помощью пипетки 1-2 раза в сутки в камерах A и B по отдельности, следуя «Общей процедуре заполнения жидкостью».

Совет: Небольшой объем раствора / суспензии клеток может перетекать через соединительную перемычку в конус противоположной камеры или вдоль стенок камеры (вдоль которых идет узкий желоб) при изменении положения заглушек во время последовательного заполнения отдельных камер.

• Опция: Чтобы улучшить разделение клеток: как только клетки в камере А будут хорошо прикреплены, очень осторожно промойте камеру А средой через отверстие для посевного материала перед сменой заглушек для посева в камере B. Большая часть межкамерного движения происходит под давлением вставки или извлечения заглушек. Рассмотрите возможность инкубации до 12 часов между посевами в камерах A и B, в зависимости от эксперимента.

Подключение оборудования для межклеточных взаимодействий

• Подключите контроллер давления OB1 к внешнему источнику давления, используя пневматическую трубку, и к компьютеру через USB кабель. Для детальных инструкций по настройке контроллера OB1 смотрите руководство пользователя.
• Подключите детекторы скорости потока к контроллеру OB1. Подробнее читайте в руководстве.
• Включите контроллер OB1, нажав переключатель питания.
• Запустите ПО Elveflow. Основные функции и опции умного интерфейса ПО Elveflow описаны в руководстве пользователя.
• Нажмите Добавить прибор \ выберите OB1 \ настроить как MK3+, задайте давление каналов, если необходимо, дайте прибору имя и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Теперь контроллер OB1 должен быть в списке распознанных устройств.
• Перед первым использование OB1 требует калибровки.
• Добавьте детекторы скорости потока: нажмите Добавить датчик \ выберете датчик потока \ аналоговый или цифровой (выберете рабочий диапазон скорости потока для датчика, если у он аналоговый), дайте датчику имя, выберете к какому прибору и каналу подключен датчик и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш датчик скорости потока должен быть в списке распознанных устройств.
• Откройте окно OB1.

Продув системы

• Заполните резервуар для образца средой и подсоедините прилагаемую трубку с внешним диаметром 1/16 дюйма и гибкую трубку с внешним диаметром 4 мм к резервуару.

• Подключите резервуар к соответствующему выходу контроллера давления OB1.
• Подсоедините прилагаемую трубку с внешним диаметром 1/16 дюйма с помощью фитинга 1/4 ”-28 от резервуара со средой к ловушке для пузырьков.
• Для измерения скорости потока подключите датчик между ловушкой для пузырьков и микрофлюидным чипом.
• Для точной настройки системы и получения наилучших характеристик с точки зрения управления скоростью потока добавьте трубку сопротивления (длина 15 см при внутреннем диаметре 100 мкм) к выходному отверстию датчика скорости потока.

Совет: Сопротивление всегда следует размещать после MFS (между MFS и микрофлюидным чипом), чтобы обеспечить стабильное измерение.

• Поместите открытый конец трубки, идущей от датчика потока, над емкостью для сбора отходов.
• Подайте давление в резервуар для жидкости и ждите пока жидкость не начнет капать из выхода.

Перфузия через микрофлюидный чип

• После того, как клетки будут хорошо прикреплены в статических условиях, выберите порты для пропускания потока, например, порт 3 как вход для жидкости и порт 4 как выход для жидкости. Снимите заглушки с этих портов и убедитесь, что остальные заглушки в остальных портах надежно закреплены.
• Убедитесь, что микрофлюидный чип полностью заполнен и что из впускного и выпускного отверстий выходит большая капля жидкости.
• Добавьте силиконовую муфту и соединитель Mini Luer к трубке, идущей от датчика скорости потока к части трубки, идущей к емкости сбора жидкости.
• Задайте низкое давление (или скорость потока) из резервуара для жидкости, пока на выходе из разъема Mini Luer не появится капля жидкости.

Совет: Держите разъем вверх, чтобы удалить весь воздух.

• Подсоедините и надёжно закрепите трубку к впускному отверстию микрофлюидного чипа (т. е. к порту 3).
• Подсоедините и надёжно закрепите выпускную трубку к выпускному отверстию микрофлюидного чипа (т. е. к порту 4).
• Установите давление (или скорость потока), чтобы начать перфузию среды в соединенные между собой камеры и начать межклеточные взаимодействия.

Совет: профиль потока может быть постоянным, пульсирующим или кастомизированным. 

Разделение клеток по камерам A и B

Камера A: посев MCF7 (окрышены Calcein AM)

Камера B: посев HEK293 (окрашены Hoechst 33342)

Камера A

Камера A, засеянная клетками MCF7 (окрашены кальцеином, зеленый цвет). A.) Инфильтрация клеток HEK293 (Hoechst 33342, синий) на 3 мм в камеру A от центрального конуса (масштаб 500 мкм). B.) Изображение клеток в камере A в светлом поле, объединенное с флуоресцентным изображением клеток HEK293 (синий) в самой дальней точке проникновения в камеру A (вставка из панели A; масштаб 100 мкм). C.) Изображение B, объединенное с флуоресцентным изображением клеток MCF7 (кальцеин AM, зеленый; масштаб 100 мкм).

Камера B

Камера B, засеянная клетками HEK293 (окраска Hoechst, синий). A.) Все клетки в позиции (i) чипа (красная вставка) относятся к HEK293. Клетки MCF7 проникли в камеру B вдоль нижней стенки (~ 20% клеток в позиции (ii) в чипе).