Микрофлюидный чип Cellpuri™ от Curiosis для концентрации клеток без центрифугирования

Введение

Разделение и сбор клеток является важной процедурой для большинства экспериментов с клеточными культурами, включая замену среды, промывку клеток и удаление мусора во время субкультивирования, посева и размораживания. До настоящего времени сбор клеток осуществлялся путем их гранулирования с помощью центрифуги. Центрифугирование - это метод отделения и осаждения частиц из раствора, основанный на их форме, размере, плотности и скорости вращения ротора. Вращение ротора создает центробежную силу на клетки в жидкой среде, а биологическое центрифугирование - это процесс использования этой центробежной силы для разделения и очистки клеточной смеси. Поскольку осаждение клеток происходит со скоростью, пропорциональной приложенной центробежной силе, иногда мощная центробежная сила, создаваемая центрифугой, может быть приложена к каждой клетке в образце, особенно при высокой скорости вращения ротора. Увеличение приложенного центробежного поля на высоких скоростях вращения может вызвать механический стресс в клетках, опосредованный центрифугированием, и выработку цитокинов, участвующих в воспалительном процессе [HG Kim et al. 2008]. Также сообщалось, что гравитационное поле при центрифугировании вызывает изменения в силах тяги клеток и цитоскелетную перестройку как часть клеточного механоответа [Eckert J et al. 2021].

Компания Curiosis Inc. недавно разработала чип Cellpuri - устройство для концентрирования клеток без центрифугирования, которое снижает напряжение сдвига жидкости всего за несколько секунд, тем самым минимально воздействуя на клетки с точки зрения механического стресса. Более того, в отличие от центрифугирования, клеточный концентрат можно получить без необходимости тщательно удалять супернатант после разделения. Целью данного исследования является проверка эффективности недавно разработанного чипа для обогащения клеток по сравнению с традиционным методом центрифугирования.

Материалы и методы

Подготовка клеток

Для тестирования эффективности микрофлюидных чипов Cellpuri использовали семь типов адгезивных или суспензионных клеточных линий. Клетки Jurkat, HL60, Raji и K562 были включены в тест суспензионных клеток, а клетки NIH3T3, HeLa и MCF7 использовались в качестве линии адгезивных клеток. Суспензионные клетки получали из культурального сосуда непосредственно, а адгезивные клетки - после трипсинизации и добавления культуральной среды. Для оценки эффективности экспериментов все типы клеток разводили в концентрации 2х10⁵ клеток/мл или 2х10⁶ клеток/мл. Для измерения концентрации живых и мертвых клеток использовали автоматический флуоресцентный счетчик клеток FACSCOPE (CURIOSIS Inc.). Клетки HL60 центрифугировали при 200g в течение 10 минут, а супернатант тщательно аспирировали с помощью аспирационной пипетки, чтобы сравнить с выходом центрифуги.

Работа с микрофлюидным чипом Cellpuri

Рисунок 1. Иллюстрация работы микрофлюидного чипа

В соответствии с инструкцией по эксплуатации, подготовленные клетки набирали в шприц [типа Luer-lock], затем наконечник шприца подсоединяли к входу чипа Cellpuri и нажимали на плунжер шприца, чтобы ввести клеточную суспензию в чип с помощью вертикального шприцевого насоса (CURIOSIS Inc.) (рис. 1). После завершения операции концентрированные клетки собирали на выходе из чипа Cellpuri с помощью пипетки. Бесклеточная среда и мусор, удаленные в процессе концентрирования, выбрасывались в качестве отходов.

Измерение обогащения и количества клеток на выходе чипа Cellpuri

Клетки разделяются в зависимости от их размера, формы и деформируемости во время прохождения клеточной суспензии через чип. Обогащение и «выход» - важные факторы, которые необходимо учитывать при оценке эффективности чипа.

Обогащение определяется как

«Выход» определяется как

Результаты и обсуждение

Гранулирование клеток с помощью центрифугирования позволяет концентрировать клетки, удаляя среду, смешанную с клетками. Была предпринята попытка продемонстрировать, что чипы Cellpuri эффективно концентрирует клетки без повреждения. В результате измерения эффективности концентрации Cellpuri в адгезивных и суспензионных клеточных линиях при двух исходных различных концентрациях было подтверждено, что обогащение клеток с помощью Cellpuri в среднем в 22,79 раза по сравнению с исходной концентрацией. Суспензионные клетки были обогащены в 23,52 раза и 21,37 раза при низкой и высокой концентрации клеток, соответственно (рис. 2А). Обогащение в 24,55 раза и 21,93 раза также наблюдалось в адгезивных клетках при низкой и высокой концентрациях, соответственно (рис. 2В). Поскольку существенных различий в обогащении не наблюдалось ни в суспензионных, ни в адгезивных клетках, прогнозируется, что Cellpuri можно использовать независимо от типа клеток.

Рисунок 2. Обогащение клеток с помощью чипа Cellpuri с использованием различных клеточных линий при двух исходных концентрациях (A) Клетки Jurkat (n=12), HL60 (n=10), Raji (n=16) и K562 (n=16) были использованы для теста суспензионных клеток при двух концентрациях. (B) Клетки NIH3T3 (n=10), HeLa (n=6), MCF7 (n=9) использовались для тестирования клеток адгезии в двух концентрациях.

В это время выход клеток, сконцентрированных через чип, составил в среднем 94,92% как для адгезивной, так и для суспензионной линии клеток (рис. 3A и 3B).

Рисунок 3. Выход при обогащении двух начальных концентраций клеток в различных клеточных линиях. (A) Клетки Jurkat (n=12), HL60 (n=15), Raji (n=16) и K562 (n=16) были использованы для анализа суспензионных клеток в двух концентрациях. (B) Клетки NIH3T3 (n=10), HeLa (n=6) и MCF7 (n=9) использовались для тестирования клеток адгезии в двух концентрациях.

Рисунок 4. Сравнение выхода в Cellpuri и центрифуге. Значение P (***p<0,001, непарный t-тест) указывает на статистически значимую разницу в урожайности между чипом и центрифугой. (n≥10).

При гранулировании клеток центрифугированием супернатант культуральной среды необходимо удалять осторожной аспирацией, что, тем не менее, неизбежно приводит к потере клеток. Поэтому было проведено сравнение выхода клеток HL60 при концентрации клеток с помощью Cellpuri и центрифугирования. Как показано на рисунке 4, было обнаружено, что скорость восстановления снизилась в центрифуге из-за большей потери клеток после аспирации по сравнению с чипом для обогащения клеток, что привело к снижению выхода при центрифугировании до 88,87% по сравнению с чипом для обогащения клеток, который составляет 98,44% (рисунок 4).

Согласно приведенным выше результатам, Cellpuri может концентрировать клетки с высоким коэффициентом восстановления 94,92%, исключая необходимость удаления надосадочной жидкости, поэтому ожидается, что он будет лучше использоваться для концентрации клеток в качестве альтернативы центрифугированию. Кроме того, для концентрации клеток с помощью центрифугирования они подвергаются воздействию центробежной силы в течение более 5 минут, тогда как в случае с Cellpuri на клетки воздействует только сила сдвига, проходящая через чип в течение всего нескольких секунд. Это означает, что при использовании Cellpuri клетки меньше подвергаются механическому воздействию, поэтому влияние на функции клеток оказывается минимальное по сравнению с методом центрифугирования.