Тестирование биопленки в потоке с использованием микрофлюидного чипа

Бактерии способны прикрепляться к большинству поверхностей и со временем образуют сообщества, известные как биопленки, при благоприятных условиях.

Бактериальные биопленки присутствуют во многих важных явлениях нашей повседневной жизни, как полезных, так и вредных. От зубного налета до обрастаний на кораблях, хронических инфекций и экологически чистых удобрений. Исследования по биопленкам, имеющим множество потенциальных применений, продолжаются. Однако большую часть времени биопленки изучают в объемных культурах, в статических или ex situ условиях, что не отражает их динамическую природу.

В этой статье биопленки будут выращиваться в простом канале микрофлюидного чипа для наблюдения за их развитием на месте в условиях потока, чтобы улучшить экологическую значимость, а затем проверить их свойства.

Применение тестирования биопленки

• Толерантность к антибиотикам и резистентность
• Заселение поверхностей бактериями
• Эволюция бактериальных сообществ
• Взаимодействие видов микроорганизмов
• Образование биопленки

Экспериментальное оборудование

Контроллер потока

Детектор скорости потока

Микрофлюидный чип Fluidic 145

Рисунок 1 Схема установки

Аппаратное обеспечение Контроллер OB1 mk4 1 цифровой датчик расхода MFS2 0–7 мкл/мин Трубки, фитинги и резервуары Fluidic 145 от Microfluidic ChipShop Сопротивления длиной 20 см с внутренним диаметром 100 мкм Стерильный мембранный фильтр для шприцев PES диаметром 33 мм, размером пор 0,2 мкм (Dutscher, Франция) Микрофлюидные штекерные и гнездовые коннекторы Люэра на ¼”-28 (Darwin microfluidics, Франция) Микроскоп для наблюдения Ламинарный вытяжной шкаф Спектрофотометр

Химикаты Среда для лизогенного бульона (LB) (Sigma) Бактериальный штамм: Bacillus subtilis Глицерин (опционально) Хлорид марганца (опционально) Программное обеспечение ESI ПО

Дизайн чипа

Предлагаемая микросхема состоит из четырех различных устройств с прямым каналом. В этом приложении использовался канал с сечением 50×50 мкм. Любая другая ширина и длина также могут работать, но скорость потока будет иметь другой профиль скорости, который может повлиять на формирование биопленки. TOPAS был выбран за его химическую стойкость к этиловому спирту, что позволяет использовать обычные дезинфицирующие средства в случае протечек или любого загрязнения поверхности без ущерба для целостности чипа.

Параметры	Значения
Способ подключения	Mini Luer
Ширина канала	50 мкм
Высота канал	50 мкм
Материал	TOPAS (COC)
Поверхностная обработка	Нет
Толщина крышки	140 мкм

Инструкция по началу работы

Подключение прибора

1. Подключите контроллер давления OB1 к внешнему источнику давления с помощью пневматической трубки и к компьютеру с помощью кабеля USB.
2. Подсоедините датчик потока к OB1.
3. Включите OB1, нажав кнопку питания.
4. Запустите программу Elveflow.
5. Нажмите Add instrument \ выберите OB1 \ установите, как MK4, при необходимости установите каналы давления (если необходимо), дайте имя прибору и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Теперь ваш OB1 должен быть в списке распознанных устройств.
6. Калибровка OB1 требуется при первом использовании.
7. Добавьте датчик расхода: нажмите Add sensor\выберите датчик расхода\аналоговый или цифровой (выберите рабочий диапазон скорости потока для датчика, если у вас аналоговый), дайте имя датчику, выберите к какому устройству и каналу датчик подключен, и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш датчик потока должен быть в списке распознанных устройств.
8. Откройте окно OB1.
9. В окне OB1 в каждом из рабочих каналов откройте настройки, связанные с датчиком, и в значениях PID измените как чувствительность, так и плавность с 0,001 на 0,008.

Советы от эксперта. Эти параметры адаптированы к воде, если используются жидкости с разными свойствами и вязкостью, эти значения нуждаются в регулировке для надежного регулирования потока.

Приготовление раствора

1. Для бактериальной суспензии: Под ламинарным вытяжным шкафом заполните резервуар стерильной средой LB и инокулируйте ночной культурой при 37 ° C (оптическая плотность> 1) и регулируйте до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,1.
2. Для питательной среды: под ламинарным колпаком налейте свежую среду LB в резервуар и добавьте любые реагенты для тестирования. В этом случае добавляли 1% (масса/объем) глицерина и 0,1 мМ MnCl2.
3. Закройте резервуар черной напорной крышкой, в которую уже вставлена стерильная трубка с внешним диаметром 1/32 дюйма. Закройте входное отверстие для сжатого воздуха лентой во избежание загрязнения, пока оно не будет подключено к OB1.

Подготовка к настройке

• Соедините крышку резервуара с OB1 пневматической трубкой.
• Подсоедините резервуар к MFS2 с помощью трубки 1/32 дюйма. Добавьте сопротивление длиной 20 см и 100 мкм внутреннего диаметра к микрофлюидной трубке и к выходу датчика потока.
• Подсоедините конец сопротивления к трубке 1/32 дюйма, используя соединитель.

Советы от эксперта. Для получения более подробной информации об использовании сопротивления для получения наилучших характеристик с точки зрения управления скоростью потока.

• Откройте индивидуально упакованный стерильный фильтр для шприца. Подсоедините трубку 1/32” к фитингу Люэра с наружной резьбой, затем добавьте мембранный фильтр шприца, а затем добавьте фитинг Люэра с внутренней резьбой и трубку 1/32”.

Советы от эксперта. Бактерии имеют тенденцию образовывать биопленку внутри всех трубок, к которым у них есть доступ, что может повлиять на работу MFS2 и со временем засорить трубки сопротивления. Чтобы защитить микрофлюидный контур, в линию можно добавить стерильный шприцевой фильтр, чтобы предотвратить попадание бактерий на какой-либо компонент, расположенный выше по потоку, и в резервуар со стерильной средой.

• Подсоедините свободный конец трубки 1/32 дюйма к мини-фитингу Люэра.
• Под ламинарным колпаком извлеките чип из упаковки и инокулируйте его бактериальной суспензией. Используйте пипетку, чтобы полностью заполнить чип от одного конца до другого и закрыть входные отверстия парафильмом, чтобы предотвратить загрязнение.
• Подключить чип (поскольку чип прямоканальный, вход и выход взаимозаменяемы).
• Подсоедините трубку 1/32 дюйма к выходному отверстию чипа с помощью мини-фитинга Люэра и закрепите другой конец в безопасном контейнере для отходов.

Советы от эксперта. Отходы, зараженные бактериями, представляют биологическую опасность. Таким образом, они должны содержаться в соответствии с уровнем безопасности красителя, используемого для обеспечения безопасности.

Эксперименты

• Оставьте микрожидкостный чип не менее чем на 30 минут, чтобы бактерии могли прикрепиться к стенкам. Это время может варьироваться в зависимости от штамма.

Советы от эксперта. После инкубации воздух сначала будет проталкиваться через чип, вытесняя всю бактериальную взвесь. Большинство прикрепленных клеток останутся прикрепленными после проталкивания воздуха с предложенной скоростью потока. Также можно сначала выпустить воздух из трубки при отсоединенном чипе, а затем снова подключить чип с помощью жидкости, текущей медленно.

• Поместите чип на предметный столик микроскопа. В окне управления OB1 выберите соответствующий канал к резервуару и пропустите среду со скоростью 5 мкл/мин, пока фильтр почти не заполнится раствором.
• Установите значение скорости потока на 1 мкл/мин и подождите, пока раствор не достигнет резервуара для отходов.
• Оставьте установку включенной на необходимое время. В этом случае значительный рост биопленки был достигнут через 9 часов. В одном и том же канале в одном эксперименте может образовываться множество биопленок, считая повторы для одних и тех же условий.

Результаты микрофлюидного тестирования биопленки

Промежуток времени формирования и развития биопленки под потоком был получен путем фотографирования одной и той же биопленки в разные моменты времени (рис. 1). В проведенном эксперименте внутри микрофлюидного канала сформировались три биопленки, размеры которых были количественно определены с течением времени (рис. 2). При желании резервуар с питательной средой можно заменить после развития биопленки для проверки действия различных веществ, например, антибиотиков. Точно так же можно использовать красители для окрашивания бактерий и получения флуоресцентных изображений.

Рисунок 2. Рост биопленки в микрожидкостном канале. А-С. Интервальные изображения той же биопленки в светлом поле через 1, 5 и 9 часов. D. Флуоресцентное микроскопическое изображение биопленки через 9 часов. Масштаб представляет собой 25 мкм.

Рисунок 3. Количественная оценка роста биопленки с течением времени. Измеряли площадь поверхности трех отдельных биопленок (синие, оранжевые, серые точки) в течение 9 часов роста в потоке в микрожидкостном канале.