Тестирование биопленки в потоке с использованием микрофлюидного чипа

Бактерии способны прикрепляться к большинству поверхностей и со временем образуют сообщества, известные как биопленки, при благоприятных условиях.

Бактериальные биопленки присутствуют во многих важных явлениях нашей повседневной жизни, как полезных, так и вредных. От зубного налета до обрастаний на кораблях, хронических инфекций и экологически чистых удобрений. Исследования по биопленкам, имеющим множество потенциальных применений, продолжаются. Однако большую часть времени биопленки изучают в объемных культурах, в статических или ex situ условиях, что не отражает их динамическую природу.

В этой статье биопленки будут выращиваться в простом канале микрофлюидного чипа для наблюдения за их развитием на месте в условиях потока, чтобы улучшить экологическую значимость, а затем проверить их свойства.

Применение тестирования биопленки

• Толерантность к антибиотикам и резистентность
• Заселение поверхностей бактериями
• Эволюция бактериальных сообществ
• Взаимодействие видов микроорганизмов
• Образование биопленки

Экспериментальное оборудование

Рисунок 1 Схема установки

Дизайн чипа

Предлагаемая микросхема состоит из четырех различных устройств с прямым каналом. В этом приложении использовался канал с сечением 50×50 мкм. Любая другая ширина и длина также могут работать, но скорость потока будет иметь другой профиль скорости, который может повлиять на формирование биопленки. TOPAS был выбран за его химическую стойкость к этиловому спирту, что позволяет использовать обычные дезинфицирующие средства в случае протечек или любого загрязнения поверхности без ущерба для целостности чипа.

Инструкция по началу работы

Подключение прибора

1. Подключите контроллер давления OB1 к внешнему источнику давления с помощью пневматической трубки и к компьютеру с помощью кабеля USB.
2. Подсоедините датчик потока к OB1.
3. Включите OB1, нажав кнопку питания.
4. Запустите программу Elveflow.
5. Нажмите Add instrument \ выберите OB1 \ установите, как MK4, при необходимости установите каналы давления (если необходимо), дайте имя прибору и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Теперь ваш OB1 должен быть в списке распознанных устройств.
6. Калибровка OB1 требуется при первом использовании.
7. Добавьте датчик расхода: нажмите Add sensor\выберите датчик расхода\аналоговый или цифровой (выберите рабочий диапазон скорости потока для датчика, если у вас аналоговый), дайте имя датчику, выберите к какому устройству и каналу датчик подключен, и нажмите OK, чтобы сохранить изменения. Ваш датчик потока должен быть в списке распознанных устройств.
8. Откройте окно OB1.
9. В окне OB1 в каждом из рабочих каналов откройте настройки, связанные с датчиком, и в значениях PID измените как чувствительность, так и плавность с 0,001 на 0,008.

Советы от эксперта. Эти параметры адаптированы к воде, если используются жидкости с разными свойствами и вязкостью, эти значения нуждаются в регулировке для надежного регулирования потока.

Приготовление раствора

1. Для бактериальной суспензии: Под ламинарным вытяжным шкафом заполните резервуар стерильной средой LB и инокулируйте ночной культурой при 37 ° C (оптическая плотность> 1) и регулируйте до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,1.
2. Для питательной среды: под ламинарным колпаком налейте свежую среду LB в резервуар и добавьте любые реагенты для тестирования. В этом случае добавляли 1% (масса/объем) глицерина и 0,1 мМ MnCl2.
3. Закройте резервуар черной напорной крышкой, в которую уже вставлена стерильная трубка с внешним диаметром 1/32 дюйма. Закройте входное отверстие для сжатого воздуха лентой во избежание загрязнения, пока оно не будет подключено к OB1.

Подготовка к настройке

• Соедините крышку резервуара с OB1 пневматической трубкой.
• Подсоедините резервуар к MFS2 с помощью трубки 1/32 дюйма. Добавьте сопротивление длиной 20 см и 100 мкм внутреннего диаметра к микрофлюидной трубке и к выходу датчика потока.
• Подсоедините конец сопротивления к трубке 1/32 дюйма, используя соединитель.

Советы от эксперта. Для получения более подробной информации об использовании сопротивления для получения наилучших характеристик с точки зрения управления скоростью потока.

• Откройте индивидуально упакованный стерильный фильтр для шприца. Подсоедините трубку 1/32” к фитингу Люэра с наружной резьбой, затем добавьте мембранный фильтр шприца, а затем добавьте фитинг Люэра с внутренней резьбой и трубку 1/32”.

Советы от эксперта. Бактерии имеют тенденцию образовывать биопленку внутри всех трубок, к которым у них есть доступ, что может повлиять на работу MFS2 и со временем засорить трубки сопротивления. Чтобы защитить микрофлюидный контур, в линию можно добавить стерильный шприцевой фильтр, чтобы предотвратить попадание бактерий на какой-либо компонент, расположенный выше по потоку, и в резервуар со стерильной средой.

• Подсоедините свободный конец трубки 1/32 дюйма к мини-фитингу Люэра.
• Под ламинарным колпаком извлеките чип из упаковки и инокулируйте его бактериальной суспензией. Используйте пипетку, чтобы полностью заполнить чип от одного конца до другого и закрыть входные отверстия парафильмом, чтобы предотвратить загрязнение.
• Подключить чип (поскольку чип прямоканальный, вход и выход взаимозаменяемы).
• Подсоедините трубку 1/32 дюйма к выходному отверстию чипа с помощью мини-фитинга Люэра и закрепите другой конец в безопасном контейнере для отходов.

Советы от эксперта. Отходы, зараженные бактериями, представляют биологическую опасность. Таким образом, они должны содержаться в соответствии с уровнем безопасности красителя, используемого для обеспечения безопасности.

Эксперименты

• Оставьте микрожидкостный чип не менее чем на 30 минут, чтобы бактерии могли прикрепиться к стенкам. Это время может варьироваться в зависимости от штамма.

Советы от эксперта. После инкубации воздух сначала будет проталкиваться через чип, вытесняя всю бактериальную взвесь. Большинство прикрепленных клеток останутся прикрепленными после проталкивания воздуха с предложенной скоростью потока. Также можно сначала выпустить воздух из трубки при отсоединенном чипе, а затем снова подключить чип с помощью жидкости, текущей медленно.

• Поместите чип на предметный столик микроскопа. В окне управления OB1 выберите соответствующий канал к резервуару и пропустите среду со скоростью 5 мкл/мин, пока фильтр почти не заполнится раствором.
• Установите значение скорости потока на 1 мкл/мин и подождите, пока раствор не достигнет резервуара для отходов.
• Оставьте установку включенной на необходимое время. В этом случае значительный рост биопленки был достигнут через 9 часов. В одном и том же канале в одном эксперименте может образовываться множество биопленок, считая повторы для одних и тех же условий.

Результаты микрофлюидного тестирования биопленки

Промежуток времени формирования и развития биопленки под потоком был получен путем фотографирования одной и той же биопленки в разные моменты времени (рис. 1). В проведенном эксперименте внутри микрофлюидного канала сформировались три биопленки, размеры которых были количественно определены с течением времени (рис. 2). При желании резервуар с питательной средой можно заменить после развития биопленки для проверки действия различных веществ, например, антибиотиков. Точно так же можно использовать красители для окрашивания бактерий и получения флуоресцентных изображений.

Рисунок 2. Рост биопленки в микрожидкостном канале. А-С. Интервальные изображения той же биопленки в светлом поле через 1, 5 и 9 часов. D. Флуоресцентное микроскопическое изображение биопленки через 9 часов. Масштаб представляет собой 25 мкм.

Рисунок 3. Количественная оценка роста биопленки с течением времени. Измеряли площадь поверхности трех отдельных биопленок (синие, оранжевые, серые точки) в течение 9 часов роста в потоке в микрожидкостном канале.