Арт. STEDYCON
В стандартном лазерном сканирующем флуоресцентном микроскопе возбуждающий лазер фокусируется линзой объектива для создания фокального пятна, которое используется для исследования распределения флуоресцентных маркеров в образце. Из-за волновой природы света это пятно излучения возбуждения никогда не может быть бесконечно малой точкой. Скорее, это размытое распределение интенсивности света, также называемое функцией рассеяния точки (ФРТ). Как только флуорофоры возбуждаются этим пятном, испускаемая флуоресценция улавливается линзой объектива, отделяется от возбуждающего света оптическими фильтрами, направляется через конфокальное отверстие и регистрируется детектором. Точечное отверстие (пинхол) используется для обеспечения эффекта оптического секционирования, которым известна конфокальная микроскопия. Оно позволяет только флуоресценции, исходящей из фокальной плоскости, проходить и достигать детектора, в то время как свет, исходящий от областей вне фокуса блокируется. Интересно, что не только фокусирующие, но также измерительные параметры могут быть описаны ФРТ.
Часто в системе присутствует несоответствие коэффициентов преломления иммерсионной жидкости и среды образца. Несовпадение коэффициентов преломления и неоднородность образца могут сильно ухудшить производительность микроскопа. Адаптивная оптика позволяет устранить эти проблемы и сделать систему дифракционно-ограниченной.
Пространственная протяженность ФРТ, обусловленная конечной длиной волны света, является причиной того, что стандартный конфокальный микроскоп называют «дифракционно-ограниченным». В микроскопе, использующем метод подавления спонтанного испускания (STED) дополнительный лазер фокусируется на образце вместе с возбуждающим лучом. Этот STED-лазер подавляет флуоресценцию за счет стимуляции излучательных переходов. В частности, с помощью специальной ФРТ в форме "пончика", луч 2 лазера избирательно удерживает молекулы, находящиеся вне центра, в нефлуоресцентном состоянии, позволяя флуоресцировать только тем молекулам, которые находятся в центральной области пончика с нулевой интенсивностью. Таким образом, флуоресценция ограничивается гораздо меньшей областью, чем без STED, т.е. нарушается дифракционный предел и достигается сверхразрешение.
Образец - часть оптического пути
Дифракционный предел диктует минимально возможный размер ФРТ излучения возбуждения в идеальной ситуации. На практике несовершенства оптического пути, от лазерных источников до образца включительно и обратно к детекторам, ухудшают свойства визуализации микроскопа и деформируют его ФРТ, ограниченную дифракцией. Образец заслуживает особого внимания. В то время как дефекты оптики статичны и поэтому легко измеряются и исправляются, неоднородности в образце непредсказуемы и варьируются от образца к образцу и даже в пределах одного поля зрения. Эти дефекты и неоднородности вызывают оптические аберрации, которые, если их не исправить, приводят к тому, что ФРТ излучения возбуждения микроскопа становится более размытым, что снижает разрешающую способность системы и эффективность возбуждения. Кроме того, флуоресценция, которая была бы идеально сфокусирована на точечном отверстии, становится размытой и может быть заблокирована точечным отверстием, что приводит к неэффективной регистрации.
Рис.1 Слева: несоответствие показателей преломления среды образца и иммерсионной среды приводит к отклонению лучей от номинального фокуса. Аналогичные эффекты могут быть вызваны локальными неоднородностями образца. Справа: использование деформируемого зеркала для правильного предварительного перенаправления всех лучей до того, как они попадут в линзу объектива, эффективно нейтрализует любые негативные эффекты.
Микроскопы сверхвысокого разрешения предъявляют особенно высокие требования качеству оптики. В STED-микроскопе основное внимание уделяется ФРТ STED-лазера. Если луч STED улавливает аберрации на пути к фокальной плоскости, центр ФРТ STED будет иметь конечную ненулевую интенсивность. Эта, обладающая аберрацией ФРТ STED, может привести к полной блокировке флуоресценции, а не просто ограничению ее центром кольца, что приведет к большим потерям сигнала и разрешения. Проблема особенно очевидна при работе с трехмерным (3D-) STED. В то время как центр нулевой интенсивности двумерного бублика STED несколько устойчив к аберрациям, центр 3D-STED ФРТ быстро становится ненулевым, даже если присутствуют только незначительные аберрации.
Приблизительное соответствие недостаточно
Основным источником аберраций в микроскопии являются области образца с неоднородными показателями преломления. Когда свет сталкивается с изменением показателя преломления, лучи изгибаются и продолжают двигаться в другом направлении - явление известное как преломление. При разработке линз рефракция является желаемым эффектом, и производители уделяют большое внимание оптимизации рефракции, чтобы линзы создавали идеальные (т.е. ограниченные дифракцией) ФРТ. К несчастью, последующие произвольные изменения показателя преломления вдоль пути оптического луча микроскопа ставят под угрозу эту точную фокусирующую способность. Одной из наиболее заметных причин нежелательного изменения показателя преломления является граница раздела между покровным стеклом и средой образца, где несоответствие показателей может вызвать сферические аберрации и расфокусировку (рис. 1).
Расфокусировка изменяет глубину резкости и может привести к тому, что измерения расстояния по оси z будут давать неверные результаты, в то время как сферические аберрации приводят к неоптимальной форме ФРТ с характерными длинными хвостами и множественными максимумами. Современные масляные объективы с высокой числовой апертурой разработаны с учетом границы раздела покровное стекло и иммерсионная среда. Однако показатель преломления (nOIL = 1.518 при 23 °C) считается постоянным после этого, то есть в образце. Таким образом, заливка образца средой Mowiol с показателем преломления 1.40–1.49 вызовет аберрации, и тем не менее, это по-прежнему одно из лучших решений среди сред для заливки образца при работе с объективами, требующими масляную иммерсию, уступая место заливке образца в TDE, что не всегда подходит, например для экспериментов с живыми клетками. Аналогично, причина, по которой существуют объективы с водной иммерсией, заключается в том, что они близко соответствуют показателю преломления, необходимому для работы с живыми клетками, и аналогичные аргументы справедливы для иммерсионных объективом с глицерином и силиконовым маслом.
|
|
Рис. 2 Вариации показателей преломления в образце могут искажать волновые фронты, приводя к несовершенному фокусу. Ключевая причина, по которой почти всегда присутствует некое расширение, это несоответствие показателя преломления между средой образца и иммерсионной жидкостью, хотя локальные колебания показателя преломления образца могут тоже привести к аберрациям. Использование деформируемого зеркала позволяет эффективно устранить аберрации. Деформируемые зеркала – это адаптивные элементы с отражающей поверхностью, форма которой регулируется. При применении корректной формы зеркала, обратной к искажениям, вызванным образцом, фокус возвращается обратно к идеальному виду, увеличивая сигнал и разрешение даже глубоко в ткани. |
Тем не менее, несмотря на близкое соответствие между этими иммерсионными средами и образцами, для которых они были предназначены, «близость» значений показателей преломления часто недостаточна, и даже небольшое несоответствие может вызвать аберрации. Дополнительной причиной аберраций являются неоднородности показателя преломления в самом образце, например переходы между участками, обогащенными липидами или ДНК, и остальной частью клетки. Большинство аберраций становятся более серьезными при фокусировке глубоко в образец, например в толстую ткань. Это причина того, почему в многофотонной микроскопии обычно также используется коррекция аберраций. Оптические аберрации и их влияние на формы ФРТ можно аппроксимировать с помощью полиномов Цернике для моделирования соответствующей деформации волновых фронтов*. Различные порядки полиномов назначаются известным модам оптической аберрации, так что любую произвольную форму аберрации можно легко описать, разложив ее математически на составляющие ее моды Цернике.
*Обратите внимание, что лучи всегда проходят перпендикулярно фронту волн, поэтому любой из них можно использовать для отслеживания оптической системы.
Идеальная фокусировка
Оптические аберрации можно исправить с помощью адаптивной оптики. Прежде чем пучки STED и возбуждения попадут в линзу объектива, они «предварительно аберрируются» с помощью адаптивного элемента, который вызывает такую же аберрацию, что и образец, но в противоположном направлении. Следовательно, когда предварительно аберрированные лучи проходят через аберрирующий образец, два набора аберраций - первый, вызванный адаптивным элементом, а второй - образцом, - компенсируют друг друга. Кроме того, излучаемая флуоресценция, которая также искажается при прохождении через образец, также корректируется адаптивным элементом. Таким образом восстанавливаются условия дифракционно-ограниченной фокусировки и в точке регистрации (рис. 2).
|
Рис. 3 Слой флуоресцирующих шариков в условиях несоответствия коэффициентов преломления (левый столбец) и коррекции с помощью адаптивной оптики (справа). Обратите внимание, как яркость и разрешение уменьшаются с глубиной фокусировки, когда коррекция не применяется. Все изображения масштабируются до одинаковой яркости. |
Надежная и систематическая коррекция стала возможной благодаря интеграции адаптивных оптических элементов, таких как деформируемые зеркала, на пути луча. Деформируемые зеркала представляют собой мембраны с отражающим покрытием, форма которой может регулироваться. Компенсация аберраций достигается за счет изменения формы зеркала таким образом, чтобы вносимые зеркалами аберрации были равны половине значений аберраций от образца*. Подходящее деформируемое зеркало должно иметь чрезвычайно высокую отражательную способность от ультрафиолетового до инфракрасного диапазона, чтобы избежать потерь, и достаточное количество механизмов регулировки формы (более 100), чтобы точно воспроизводить аберрации на его поверхности. *Половина искажений от образца, потому что лучи собирают одну половину на пути к зеркалу, а другую половину на обратном пути. Более того, время отклика деформируемых зеркал должно быть достаточно малым (до десяти миллисекунд), чтобы корректировки можно было динамически вносить в рамках регистрации одного изображения. При внедрении деформируемых зеркал в установку микроскопа необходимо очень внимательно следить за тем, чтобы форма поверхности точно соответствовала желаемой деформации. Поэтому система с деформируемыми зеркалами требует сложных процедур калибровки, которые учитывают жесткость мембраны, сцепление регулирующих элементов и их реакцию, а также дрейф и т. д. Деформируемые зеркала имеют ряд преимуществ по сравнению с кольцами для коррекции объектива. Например, деформируемые зеркала могут корректировать произвольные аберрации, в то время как корректирующие кольца могут корректировать только
|
сферическую аберрацию. Фактически, некоторые аберрации, например наклон образца, снижает эффект корректирующих колец, так что их корректировка делает результирующее изображение скорее хуже, чем лучше. Кроме того, деформируемые зеркала обеспечивают гораздо более быстрое время отклика и, следовательно, их можно регулировать даже между линиями сканирования изображения. Они также имеют гораздо более длительный срок службы из-за своей немеханической природы, и они не вводят движущиеся части в оптический путь луча, которые могут вызвать дополнительные аберрации*.
*Обратите внимание, что перемещения регулирующих элементов зеркал незначительны (<1 мкм) по сравнению с перемещениями групп линз в объективе (мм).
Рис.4 Конфокальные (B, C) и 3D-STED (D, E) изображения в глубоких тканях с (C, E) и без (D, B) адаптивной оптики. При глубине фокусировки около 100 мкм конфокальная микроскопия все еще дает небольшой сигнал (B), хотя его можно улучшить (C). Однако 3D-STED на этих глубинах невозможен (D) без адаптивной оптики, которая восстанавливает яркость и разрешение (E). Образец: перевернутая передняя половина личинки Drosophila melanogaster L3-стадии (A). Окрашивание актина (Phalloidin-ATTO 647N). По мере регистрации изображения деформируемое зеркало с компенсацией аберраций автоматически отслеживает глубину фокусировки. После настройки сбор данных выполняется полностью автоматически для получения ярких изображений с высоким разрешением на любой глубине. Образцы Себастьяна Шнорренберга, EMBL, Гейдельберг.
Практическая реализация
Коррекция искажений волнового фронта может значительно увеличить сигнал и разрешение. Как показывает практика, большое несоответствие показателей преломления, увеличенная глубина изображения и потребность в более высоком (сверх-) разрешении - все это оправдывает использование адаптивной оптики. Пока кто-то может обойтись без коррекции аберраций для конфокального изображения вблизи покровного стекла или в образце, залитом Mowiol с использованием объектива с масляной иммерсией, эксперименты по визуализации в толстых (> 100 мкм) образцах (рис. 3, 4) или эксперименты 3D-STED всего на несколько микрон ниже поверхности образца, не дадут приемлемых результатов и потребуют использования адаптивной оптики.
Рис.5. Адаптивная оптика сохраняет разрешение и яркость глубоко внутри толстых образцов и позволяет получать изображения при низком уровне освещенности (образец: мозг пчелы, любезно предоставлено Амели Кабироль и Альбрехтом Хаазом, Университет Тренто).
Для определения точной величины коррекции, применяемой к системе адаптивной оптики, было предложено несколько алгоритмов. К счастью, самый заметный вид аберраций, вызванный рассогласованием показателей преломления, можно предсказать, используя только глубину фокусировки и величину разницы показателей преломления. Эти аберрации линейно увеличиваются с глубиной и могут быть легко исправлены при перефокусировке образца или во время объемного или xz-сканирования, когда пользователь установил их для определенного положения фокусировки. Таким образом, яркость изображения флуоресцентных шариков на глубине визуализации 250 мкм может быть улучшена до пяти раз (рис. 3).
Проведение эксперимента 3D-STED на глубине 100 мкм внутри сложного образца, такого как личинки дрозофилы, неизбежно требует адаптивной оптики. В этом сценарии сильно аберрированная ФРТ луча STED повсюду деактивирует спонтанную флуоресценцию, не оставляя полезного сигнала и, конечно же, разрешения. Здесь использование хорошей адаптивной оптики имеет решающее значение между получением результата или его отсутствием.
