Арт. Autoalignment
Несмотря на революционное повышение разрешения, конструкция микроскопа, способного работать по принципу STED (stimulated emission depletion), не разрушает устоявшуюся архитектуру конфокальной микроскопии. Более того, общий принцип того, как STED-микроскоп возбуждает флуоресценцию в образце, отсекает внефокусный свет и формирует изображение на основе детектируемого сигнала, полностью идентичен конфокальному. Однако современные STED-системы — это не просто конфокальный микроскоп с добавленными компонентами: они предъявляют особые требования к дизайну и качеству оптики.
Что есть в конфокальном микроскопе?
Как минимум один лазер (чаще — несколько), формирующий световой пучок, который фокусируется на образце с помощью объектива. Сканирующий блок перемещает фокальное пятно по образцу строка за строкой. Флуоресценция, испускаемая образцом, собирается объективом и направляется на детектор. Перед детектором расположен пинхол, обеспечивающий оптическое секицонирование. Между этими элементами находятся дихроичные зеркала, разделяющие входящее и исходящее излучение и направляющие световые пути.
Следует отметить, что это лишь базовая схема. На рынке представлено множество конфокальных микроскопов, которые в той или иной степени отличаются от описанной конфигурации.
А теперь — STED-часть
Все перечисленные выше элементы присутствуют и в STED-микроскопе, выполняя те же функции и располагаясь практически в той же конфигурации. Но появляется нечто дополнительное — то, что переводит изображение из режима с ограничением дифракции в сверхразрешение. Прежде всего, это как минимум один дополнительный лазерный источник, формирующий STED-пучок. Этот пучок проходит через устройство, преобразующее его в «бублик» с нулевой интенсивностью в центре, после чего вводится в основной оптический тракт с помощью дополнительного дихроичного зеркала.
Базовые схемы конфокальной и STED-микроскопии. Наиболее важным дополнением для STED являются STED-лазер и формирователь пучка. Однако интеграция этих компонентов в общую конструкцию связана с особыми инженерными задачами.
Рассмотрим подробнее компоненты, которые превращают обычный конфокальный микроскоп в сверхразрешающую STED-систему.
Лазер, формирующий STED-пучок, имеет длину волны, сдвинутую в красную область спектра относительно лазеров возбуждения, и, как правило, работает в импульсном режиме для снижения световой нагрузки на образец.
В оптическом пути форма STED-пучка должна быть преобразована в распределение интенсивности с нулем в центре, окружённым областью высокой интенсивности. В самой простой конфигурации эту задачу выполняет фазовая пластина. Она задерживает отдельные части пучка на половину длины волны, благодаря чему лучи в фокусе интерферируют деструктивно, а не конструктивно, как в обычном случае. Результатом деструктивной интерференции в фокусе становится нулевая интенсивность в центре, окружённая максимумами — хорошо известная форма «бублика».
Для 3D-STED требуется другая фазовая пластина. Возможность смешивать 2D- и 3D-STED в произвольной пропорции приводит к более сложной схеме с делителем пучка и двумя фазовыми пластинами — одной для 2D-STED и одной для 3D-STED. В более продвинутых STED-системах, таких как MIRAVA POLYSCLOPE от abberior, такая конфигурация заменена последовательным пространственным световым модулятором (SLM). Это позволяет избежать деления пучка, которое может приводить к серьёзным проблемам с юстировкой.
Особенности STED систем
С точки зрения набора ключевых компонентов, необходимых для перехода от конфокальной микроскопии к STED, на этом список можно было бы закончить. Однако интеграция дополнительных элементов и функций в микроскоп сопряжена с рядом серьёзных задач. Ведь цель — получение изображений с разрешением в несколько десятков нанометров, а значит требования к оптической точности и механической стабильности (дрейф, вибрации) возрастают многократно.
Именно здесь происходит естественный отбор: лишь те STED-системы, которые соответствуют этим требованиям, способны полностью реализовать потенциал сверхразрешения и формировать изображения высокого качества.
Прежде всего, STED-пучок должен быть идеально совмещён с пучками возбуждения. Здесь важна абсолютная точность: только при полном пространственном совпадении STED- и возбуждающего пучков и сохранении этого совпадения во времени возможно эффективное подавление флуоресценции. Любое отклонение приводит к снижению разрешения и потере сигнала.
Компания abberior решает эту задачу с помощью технологии Full Autoalignment — первой полностью автоматизированной процедуры юстировки всех оптических путей, включая пинхол и формирование STED-пучка. В системе STEDYCON проблема решена иначе: все лазеры вводятся в одно оптическое волокно, что обеспечивает автоматическое совмещение по конструкции.
Ещё одна особенность STED-визуализации заключается в том, что она устраняет все низкоразрешающие фотоны. В результате уровень детектируемого сигнала ниже, тогда как фон остаётся неизменным, поскольку STED-пучок на него не влияет. abberior компенсирует это с помощью специального детектора: массивный детектор MATRIX раздельно регистрирует сигнал из фокуса и вне фокуса, обеспечивая превосходное отношение сигнал/фон и делая использование пинхола необязательным.
Отдельного внимания в STED-системе требует сканер. Компания abberior оптимизировала сканер QUAD с учётом оптического качества и специфических требований STED-визуализации. Он работает без сканирующей линзы, что снижает оптические потери, и позволяет произвольно вращать поле сканирования даже в режиме STED — возможность, недоступную для большинства других сканеров.
STED микроскоп высокого качества
Специализированные STED-микроскопы — это не конфокальные микроскопы с «добавленной» STED-опцией. Они изначально разрабатываются с нуля, с прицелом на высочайшие оптические и оптомеханические требования. Очевидно, что это автоматически поднимает и уровень конфокальной визуализации: высококлассная STED-система, благодаря своему набору превосходных компонентов, является также превосходным конфокальным микроскопом.
Взгляд пользователя
Итак, в итоге для превращения конфокального микроскопа в STED-систему требуется по сути две вещи: во-первых, ввести в оптический путь лазерный пучок с формой «бублика», и во-вторых, оптимизировать все компоненты с точки зрения оптического качества.
Остаётся главный вопрос: что всё это означает для вас, специалиста, работающего с микроскопом? Сложнее ли работать со STED-микроскопом, чем с конфокальной системой?
Совсем нет. Более того, современное программное обеспечение — STEDYCON smart control и LiGHTBOX — исключительно просты в использовании. Их внутренняя логика отражает десятилетия опыта работы со STED и реализована в виде удобных настроек по умолчанию для различных сценариев. В результате получение качественного STED-изображения сводится буквально к трём кликам.
И это не подход «всё или ничего»: вы можете плавно изменять разрешение от конфокального режима к STED, просто перемещая один ползунок. Это даёт лучшее из обоих миров — от чистой конфокальной микроскопии до высококлассного сверхразрешения. Возможность работать в STED никак не лишает вас простоты конфокальных измерений.
Хорошо, скажете вы, STED несложен ни в теории, ни на практике. Но подготовка образцов! Наверняка потребуется полностью новый протокол?
И снова — нет. Некоторые корректировки действительно желательны, но в целом протокол подготовки образцов практически не отличается от стандартной конфокальной подготовки.
