Чёткие изображения в глубине образца: где конфокальная микроскопия превосходит широкопольную

В микроскопическом мире почти всё определяется структурой. Наблюдение и измерение формы, размеров, пространственных соотношений и движений на самых малых масштабах — повседневная задача в научных исследованиях. Но точные измерения требуют качественных изображений, а расфокусированный свет остаётся одной из самых назойливых проблем. Конфокальные микроскопы были разработаны именно для устранения этого фона. Как они работают? И как понять, что пришло время использовать конфокальный микроскоп? Ответ — в пинхоле (то есть в конфокальной диафрагме… и в этой статье).

Существует множество методов и типов микроскопии для самых разных задач. Среди них конфокальные микроскопы стали неотъемлемым инструментом биологической визуализации. Впервые коммерциализированные в середине 1980-х годов, они обеспечили более высокое разрешение и более чувствительное детектирование по сравнению с эпифлуоресцентными широкопольными микроскопами. Кроме того, изображения стали заметно более чёткими. Со временем приборы были дополнены возможностью z-стекинга, и современные конфокальные системы позволяют реконструировать трёхмерные изображения оптически секционированных образцов. Передовые микроскопы на основе стимулированного вынужденного излучения (STED), оснащённые матричными детекторами MATRIX, способны получать сверхразрешающие изображения живых образцов с исключительным соотношением сигнал/фон и высокой чёткостью.

Построение 3D-изображения: срез за срезом

Оптическое секционирование — это процесс получения изображений в плоскости x–y, соответствующей фокальной плоскости объектива микроскопа, с последовательным смещением вдоль оси z для формирования серии изображений по глубине образца. Если правильно совместить эти изображения, можно построить трёхмерную карту образца — подобно тому, как из ломтиков апельсина можно восстановить целый плод. Однако ценность этого подхода проявляется только тогда, когда каждый оптический срез содержит информацию исключительно от молекул, находящихся в своей фокальной плоскости. Любой расфокусированный свет от структур выше или ниже этой плоскости ухудшает чёткость реконструкции и искажает количественный анализ флуоресценции. Именно здесь эпифлуоресцентная широкопольная микроскопия оказывается недостаточной.

От «прожектора» к точечному освещению

В эпифлуоресцентном широкопольном микроскопе освещается и регистрируется вся толщина образца. Образец овещают возбуждающим светом, и флуорофоры по всей его глубине излучают ответный сигнал. Флуорофоры, находящиеся в фокальной плоскости объектива, дают чёткий и яркий сигнал, однако камера одновременно регистрирует свет от молекул выше и ниже этой плоскости. Он проявляется в виде «дымки», размывающей интересующие структуры. Обычно такой фон не критичен при работе с тонкими или разреженными образцами на малых увеличениях, и широкопольная микроскопия позволяет быстро получать качественные изображения. Однако по мере увеличения толщины образца расфокусированный свет становится всё более серьёзной проблемой, особенно при больших увеличениях.

В конфокальном микроскопе лазер освещает лишь небольшой участок образца в фокальной плоскости. Флуорофоры как в фокальной плоскости, так и вне её возбуждаются, а излучение от последних, как и в широкопольной микроскопии, оказывается размытым. Ключевое отличие заключается в том, что в конфокальной системе перед детектором установлена конфокальная диафрагма — пинхол (рис. 1). Излучение от молекул, находящихся в фокальной плоскости или близко к ней, проходит через пинхол к детектору, тогда как большая часть расфокусированного света блокируется. Благодаря этому вклад флуорофоров вне фокальной плоскости в изображение и фон значительно уменьшается, что обеспечивает более чёткие изображения. Чем меньше размер пинхола, тем эффективнее подавляется расфокусированный свет, однако тем больше полезного сигнала при этом теряется.

Рисунок 1. Упрощённая схема конфокального микроскопа.

Сканировать или вращать диск — вот в чём вопрос

До сих пор мы рассматривали регистрацию сигнала лишь из небольшой точки образца. Для получения полного изображения существуют два подхода. Первый — лазерно-сканирующая конфокальная микроскопия (LSCM), при которой изображение формируется путём последовательного сканирования поля зрения по растру. Детектором обычно служит одиночный высокочувствительный приёмник — фотоумножитель, лавинный фотодиод или аналогичное устройство, способное быстро усиливать слабый сигнал от отдельной точки. Поскольку положение сигнала определяется траекторией сканирования, камера не требуется. LSCM обеспечивает высококачественные, сфокусированные 3D-изображения толстых образцов, однако построение оптических срезов точка за точкой и последующая 3D-реконструкция требуют времени.

Более быстрым вариантом является конфокальная микроскопия со спиннинг-диском (SDCM). В таких системах одиночный пинхол заменён сотнями пинхолов, расположенных по спирали на вращающемся диске. При вращении диска пинхолы «прочёсывают» поле зрения, пропуская свет от множества точек образца одновременно к высокоэффективной CCD-камере. Это значительно ускоряет сбор сигнала по сравнению с LSCM.

Рисунок 2. В конфокальном микроскопе со спиннинг-диском два согласованных диска вращаются, пропуская возбуждающий свет к ограниченному числу точек образца и направляя эмиссионный свет от этих точек на высокоэффективную CCD-камеру.

Однако большое количество пинхолов является и ограничением SDCM. В толстых образцах наступает момент, когда расфокусированный свет начинает перекрываться с соседними пинхолами на диске. Такой свет достигает детектора и ухудшает качество изображения.

Для тонких и толстых образцов — свой микроскоп

Существует ли простое правило выбора подходящего микроскопа? В этом может помочь следующая таблица.

К чёткости — и дальше

Конфокальная микроскопия — не предел в задаче получения чистых оптических срезов и 3D-изображений. Существенным шагом вперёд по сравнению с принципом «блокировать расфокусированный свет» является стратегия «регистрировать и вычитать расфокусированный свет». Это возможно при изменении подхода к детектированию излучения. Матричный детектор MATRIX представляет собой массив фотодиодов, регистрирующих свет, испускаемый флуорофорами, под разными углами. Интеграция этих данных позволяет MATRIX отдельно регистрировать фон и полезный сигнал, после чего фон легко вычитается, формируя чёткое изображение в фокусе. В сочетании со STED-микроскопией MATRIX обеспечивает исключительную чёткость, сверхразрешение и возможность работы с живыми клетками.