Экспансионная микроскопия: увеличение образцов для повышения разрешения

Микроскопия всегда стремилась сделать невидимое видимым. Однако многие субклеточные структуры оказываются слишком маленькими или слишком плотно расположенными, чтобы их можно было разрешить с помощью дифракционно-ограниченных световых микроскопов. В попытке преодолеть это ограничение основные усилия были направлены на совершенствование самих микроскопов — увеличение их кратности увеличения и пространственного разрешения. Экспансионная микроскопия (Expansion Microscopy, ExM) является заметным исключением из этого подхода. Перенося фокус внимания с прибора на образец, экспансионная микроскопия достигает высокого разрешения не оптическим, а химическим путём. Фиксированные образцы физически увеличиваются в размерах внутри набухающего гидрогеля, что позволяет проводить трёхмерную нано-визуализацию с использованием стандартных микроскопов. Идея «настроить» сам образец может показаться заманчивой, однако она сопряжена с рядом существенных ограничений.

Как экспансионная микроскопия соотносится с методами сверхразрешающей микроскопии?

Напомним, что пространственное разрешение — это способность различать две близко расположенные точки. В случае ExM и методов сверхразрешающей микроскопии, таких как STED, PALM/STORM и MINFLUX, этими точками являются флуоресцентные метки, локализованные в гетерогенно распределённых структурах исследуемого образца. Каждый из методов использует собственный принцип для разрешения этой «скученности». В таблице 1 приведено сравнение экспансионной микроскопии с указанными методами по ряду параметров.

Таблица 1. Сравнение ExM и методов сверхразрешающей микроскопии

Рассмотрим ExM подробнее, чтобы понять, как она работает и каковы её возможности и ограничения.

«Раздувание» образцов, чтобы увидеть больше

В ExM образец инкапсулируется в гидрогель, состоящий из плотной матрицы сшитых полимеров. Эти полимеры наноразмерного масштаба формируют тонкую сетку, значительно меньшую по размеру, чем клетка, оплетая и пронизывая биомолекулы. При добавлении воды гидрогель сильно набухает, физически раздвигая молекулы. При этом относительная пространственная организация молекул сохраняется — расширение является изотропным, по крайней мере в идеальных условиях и до определённого предела (см. ниже). В качестве аналогии можно представить рисунок, нанесённый на лабораторную перчатку, которую затем надувают: частицы краски расходятся, и изображение увеличивается (рис. 1).

Рисунок 1. Подобно рисунку на лабораторной перчатке, который увеличивается при надувании, гидрогелевая матрица в ExM расширяет образец, при этом (в идеале) сохраняя пространственные соотношения между молекулами. Однако неравномерное расширение может приводить к искажениям изображения.

Протокол ExM значительно сложнее, чем простое «добавление воды». На сегодняшний день разработано несколько вариантов ExM, ориентированных на различные задачи визуализации, однако все они следуют базовому рабочему процессу. Сначала образец фиксируют, чтобы исключить вариабельность и деградацию вследствие ферментативной активности и распада тканей. Далее в ходе серии обработок клетки пермеабилизируют и внедряют в гидрогель, при этом биомолекулы ковалентно «якорят» к полимерной сети. Затем образец подвергают ферментативному или механическому расщеплению макромолекулярных структур, после чего проводят расширение в воде (рис. 2). Флуоресцентные метки могут быть добавлены как до, так и после расширения.

Рисунок 2. Общая схема подготовки образцов для экспансионной микроскопии.

Детали протокола зависят от конкретного применения. В методе protein-retention expansion microscopy (ProExM) к полимеру "прикрепляют" белки образца, тогда как в expansion fluorescent in situ hybridization (ExFISH) — молекулы нуклеиновых кислот. Итеративная экспансионная микроскопия (iExM) усиливает эффект расширения за счёт нанесения второго набухающего гидрогеля в пространство, образованное после первого расширения. Каждый вариант ExM обеспечивает собственный коэффициент увеличения и, соответственно, разрешение. В настоящее время верхний предел достигается в iExM, где эффективное разрешение порядка 15 нм возможно при использовании дифракционно-ограниченного объектива с разрешением 300 нм.

Появляются и новые подходы. Например, click-ExM сочетает клик-химию с биотинированием и окрашиванием флуоресцентно меченым стрептавидином, что позволяет визуализировать липиды, гликаны и другие малые молекулы наряду с белками, ДНК и РНК. Метод Magnify исключает этап якорения за счёт использования геля, способного универсально удерживать нуклеиновые кислоты, белки и липиды. Разнообразие протоколов ExM наглядно демонстрирует: метод остаётся достаточно сложным.

Понятный, недорогой и независимый от платформы метод

Экспансионная микроскопия обещает преодолеть многие практические и научные ограничения методов сверхразрешающей микроскопии. Во-первых, метод использует недорогие и широко доступные реагенты. Во-вторых, ExM является инструментально независимым подходом. Увеличивая расстояние между биомолекулами до уровня, при котором их можно различить даже на дифракционно-ограниченном микроскопе, ExM превращает стандартные методы визуализации в методы сверхразрешения. Таким образом, экспансионную микроскопию можно интегрировать в существующую лабораторную инфраструктуру при минимальных финансовых затратах.

Кроме того, расширенный образец представляет собой более доступную среду для визуализации. После расширения в воде образцы становятся полностью прозрачными, что облегчает и ускоряет объёмную съёмку. Наконец, окрашивание после расширения позволяет вводить большее количество меток, что увеличивает потенциал мультиплексного анализа.

Не всё, что выглядит простым действительно просто

Несмотря на привлекательность идеи «сверхразрешающей микроскопии» на базе стандартных микроскопов, ExM имеет ряд серьёзных ограничений.

Самое очевидное — полная несовместимость с исследованиями живых клеток. Клетки и ткани необходимо фиксировать, чтобы они выдержали пермеабилизацию, полимеризацию и расширение. Более того, физическое раздвижение биомолекул исключает их взаимодействие. Расширение также приводит к разбавлению сигнала — часто до 50 %, — поскольку метки, нанесённые до расширения, распределяются в большем объёме или повреждаются в процессе разделения.

Хотя на первый взгляд подготовка образцов для экспансионной микроскопии кажется простой, на практике это тонкий многоэтапный процесс, занимающий до четырёх дней, что существенно снижает пропускную способность метода. Кроме того, успешная реализация ExM требует опытного оператора. Равномерное расширение возможно только при однородном распределении полимерной сетки между и вокруг биомолекул и при равномерной гомогенизации образца, исключающей наличие структур, сопротивляющихся расширению. Такой навык приходит лишь с практикой. У начинающих пользователей расширение редко бывает изотропным во всех трёх (а фактически четырёх) измерениях, что приводит к искажениям финального изображения. Особенно в iExM ошибка 5–10 нм, вызванная анизотропным расширением, делает невозможной высокоточное наноразмерное картирование. Более того, степень расширения может различаться между органеллами одной клетки или даже между субструктурами одной и той же органеллы [Büttner M. et al., 2021].

Чтобы наглядно представить проблему анизотропного расширения, полезно снова обратиться к примеру с лабораторной перчаткой: перчатка при надувании расширяется неравномерно, и участки рисунка у пальцев или у манжеты увеличиваются меньше, чем в центральной части.

Поэтому в ExM обязательной является валидация изотропности расширения, а возможность искажений всегда должна учитываться при анализе изображений.

Подобные проблемы отсутствуют в физических методах сверхразрешения, таких как STED. Поскольку STED основан исключительно на оптических принципах, получаемые сырые данные являются финальными, а ошибки в процессе съёмки, как правило, приводят не к искажениям, а к отсутствию изображения.

Отдельной проблемой является работа с расширенными образцами. Прозрачным, нестабильным, «желеобразным» образцом трудно манипулировать, и его необходимо защищать от испарения. Высокое содержание воды исключает использование антифейдинговых агентов и требует применения исключительно водных иммерсионных объективов. Кроме того, ExM-образцы имеют большие размеры, что затрудняет их перенос, например, из чашки Петри на предметное стекло. Увеличенная толщина образца означает, что для визуализации той же структуры необходимо фокусироваться значительно глубже, иногда в 10 раз глубже, чем в нерасширенном образце. Несоответствие показателей преломления оказывает более сильное влияние; увеличение глубины съёмки приводит к росту аберраций и, как следствие, снижению сигнала и разрешения. Также становится критичным рабочее расстояние объектива.

Расширять образец или расширять возможности?

Экспансионная микроскопия — это метод визуализации, потенциально доступный любой лаборатории, располагающей стандартным микроскопом. Однако его внедрение требует длительного обучения и освоения «искусства» равномерного и воспроизводимого расширения образцов. Переход от конфокальной микроскопии к ExM значительно сложнее, чем переход, например, к STED. Кроме того, ExM полностью исключает исследования живых клеток, а также отслеживание динамики и взаимодействий, лежащих в основе жизненных процессов.

Инвестиции в технологии сверхразрешающей микроскопии, такие как STED или MINFLUX, являются оптимальным выбором для рутинных исследований. Простая и надёжная подготовка образцов с минимальным риском искажений, совместимость с живыми объектами, интуитивная работа и высокое временное разрешение, позволяющее наблюдать жизнь в динамике, — лишь часть преимуществ, делающих STED и MINFLUX привлекательными. При этом приобретение сверхразрешающей микроскопии не обязательно требует огромных затрат. STEDYCON — полнофункциональный конфокальный и STED-микроскоп размером с коробку из-под обуви — устанавливается на любой микроскоп с портом для камеры и является примером простоты и доступности.

Так какой путь расширения в сверхразрешающую микроскопию выберете вы?