Как корректировать аберрации в световой микроскопии: деформируемое зеркало или корректирующее кольцо?

Поскольку аберрации «съедают» сигнал, размывают фокус и ухудшают изображение, они доставляют исследователям, работающим на микроскопе, немало проблем. Аберрации в микроскопии — как патогены в живых системах: мы не можем устранить сам факт их существования, но можем не позволить им испортить наши научные изображения. Существуют способы вернуть отклонённые лучи на правильную траекторию, однако некоторые из них значительно эффективнее других. И адаптивная оптика с деформируемым зеркалом превосходит все альтернативы.

Что такое аберрации

Фотон — словно Дорожный Бегун с симптомами СДВГ: полный энергии, он мчится в пространстве со скоростью света, но при этом легко «отвлекается» на всё, что встречается на его пути, мгновенно отклоняясь от прямолинейного движения. И это «СДВГ» у фотона неизлечимо — оно заложено в его волновой природе, а законы физики света изменить невозможно. Согласно этим законам, свет отклоняется всякий раз, когда проходит под углом границу между средами с разными показателями преломления. Это явление называется рефракцией, а показатель преломления характеризует оптическую плотность среды и то, насколько сильно она отклоняет свет. Когда рефракция уводит лучи с их расчетной траектории, фокус размывается, а изображение становится мутным. Это и есть аберрации.

Степень отклонения света зависит не только от показателя преломления, но и от длины волны, поскольку показатель преломления обычно является функцией длины волны. Именно поэтому капли воды в воздухе могут разлагать солнечный свет на спектральные составляющие, формируя радугу. Как правило, чем короче длина волны (и выше энергия), тем сильнее отклонение.

В природе рефракция создаёт визуально красивые эффекты. Для исследователя, который работает на микроскопе, именно рефракция делает возможной работу линз. Однако она же может стать источником проблем. На пути от объектива к образцу и обратно свет проходит через воздух или иммерсионную среду, покровное стекло и монтирующую среду. Даже если их показатели преломления подобраны максимально близко друг к другу, остаточная нежелательная рефракция легко приводит к возникновению аберраций.

Рисунок 1: Аберрации искажают фокус микроскопа.

Кроме того, существует сам образец. Биологические образцы, как правило, структурно неоднородны, неупорядоченны, и бесчисленные внутренние структуры преломляют свет на его пути. Чем глубже фокус уходит в образец, тем сильнее проявляется этот эффект. В итоге сигнал может практически полностью исчезнуть.

Возвращая «заблудшие» лучи на правильный путь

Означает ли это, что мы должны ограничиться поверхностью образца, где аберрации ещё можно хоть как-то контролировать? Должны ли мы смириться с мутным изображением и признать, что ценная информация, скрытая в глубине образца, останется недоступной? И на этом всё?

Разумеется, нет. Учёные, давно размышлявшие над проблемой аберраций, пришли к решению: аберрации можно компенсировать, введя в оптический тракт элемент, создающий эффект, противоположный искажениям. Поскольку аберрации зависят от образца, иммерсионной и монтирующей сред, а также от длины волны, коррекция должна быть настраиваемой, чтобы быть пригодной для практического применения.

Один из подходов — использование объективов с корректирующим кольцом, в которых имеются подвижные группы линз для компенсации аберраций. Однако такие объективы обладают рядом существенных ограничений. Поскольку коррекция осуществляется механически, её настройки плохо воспроизводимы, и определённая неточность неизбежна. Кроме того, они не справляются с нерегулярными аберрациями, возникающими, например, из-за неоднородности образца. Коррекция происходит медленно, и даже при моторизации такие системы не могут динамически адаптироваться при перемещении фокуса вглубь образца.

Это означает, что оператору приходится выбирать, на какой глубине восстанавливать сигнал: на поверхности, где-то в середине или у дна образца. Остальная часть всегда будет оставаться тёмной и размытой. В результате объективы с корректирующим кольцом плохо подходят для 3D-сканирования.

К тому же объектив, оптимально подходящий для конкретной монтирующей среды, может вообще не выпускаться в версии с корректирующим кольцом.

Ещё одна проблема заключается в том, что при смещении линз для компенсации аберраций фокус смещается относительно исходного положения — эффект, хорошо знакомый по зум-объективам в фотографии.

В итоге можно сказать, что объективы с корректирующим кольцом в принципе способны компенсировать аберрации, но эффективно это работает лишь для статичных изображений, достаточно однородных образцов и очень ограниченного диапазона глубин. Их недостатки становятся ещё более очевидными в сверхразрешающей микроскопии. При работе с нанометровым разрешением грубая механическая неточность таких систем становится недопустимой.

Динамическая коррекция

Поэтому оставим этот подход и передадим сцену адаптивной оптике. Эта стратегия использует иной принцип возврата отклонённых лучей на правильную траекторию — деформируемое зеркало, поверхность которого может принимать произвольную форму. 140 актуаторов воздействуют на мембрану, формируя деформацию, повторяющую искажения, вносимые образцом, но с противоположным знаком. Иными словами, поверхность зеркала представляет собой «негатив» ошибки волнового фронта и тем самым компенсирует аберрации.

Рисунок 2: Деформируемое зеркало может изменять волновой фронт: a) возбуждающего света для предварительной компенсации и b) флуоресценции для коррекции аберраций.

Коррекция, достигаемая с помощью деформируемого зеркала, отличается высокой точностью и может быстро адаптироваться к различным условиям, например, к изменению глубины фокусировки. Поскольку управление актуаторами осуществляется электронно, процесс занимает миллисекунды, и коррекция может динамически следовать за фокусом во время z-сканирования, обеспечивая идеальную компенсацию по всей оси. При этом коррекция выполняется «на лету» и не влияет на положение фокуса.

Таким образом, адаптивная оптика с деформируемым зеркалом превосходит объективы с корректирующим кольцом по всем ключевым параметрам, а процесс получения изображений становится полностью автоматизированным, обеспечивая яркие, высокоразрешённые изображения от поверхности и до значительной глубины внутри образца.