Всё дело в волнах
Традиционная световая микроскопия существует уже сотни лет и продолжает играть огромную роль в развитии науки. Она позволяет заглядывать внутрь организмов и клеток и различать структуры, невидимые невооружённым глазом. Однако существует фундаментальное ограничение, мешающее различать ещё более мелкие детали, — дифракционный предел.
Даже самые мощные традиционные световые микроскопы, включая конфокальные системы, ограничены разрешением порядка половины длины волны используемого света, что соответствует примерно 200–400 нм. Две точки, расположенные ближе этого расстояния, не могут быть разделены методами классической световой микроскопии, поскольку их функции рассеяния (PSF, point spread function) перекрываются, и они воспринимаются как единый источник света.
Рис. 1. Из-за дифракции область, освещаемая сфокусированным возбуждающим лазером (зелёный), всегда больше половины длины волны используемого света. Каждая молекула (чёрная), находящаяся в этой области, излучает свет. Если таких молекул несколько, различить их невозможно.
Как перехитрить свет
Когда Штефан Хелл более двадцати лет назад изобрёл STED-микроскопию, он, разумеется, не нарушил законы физики — он просто нашёл способ их обойти. Его идея заключалась в следующем: не позволять всем флуорофорам в зоне возбуждения излучать свет одновременно, чтобы иметь возможность различать их.
Вот как это реализуется на практике. В STED, как и в конфокальной микроскопии, флуорофоры в образце возбуждаются лазерным импульсом, формирующим обычный, дифракционно ограниченный фокус. До этого момента всё стандартно. Ключевым элементом является второй лазерный импульс. Он имеет большую длину волны и временно переводит все флуорофоры, на которые попадает, обратно в основное состояние до того, как они успевают испустить фотон.
Этот эффект называется вынужденным подавлением за счёт стимулированного излучения (stimulated emission depletion), сокращённо STED. Таким образом, появляется инструмент, позволяющий целенаправленно включать и выключать флуорофоры.
Небольшое замечание. Общий принцип переключения флуорофоров между состояниями «вкл./выкл.» STED разделяет с другими методами сверхразрешающей микроскопии, такими как PALM и STORM. Однако принципиальное отличие STED заключается в том, что сверхразрешение достигается исключительно за счёт физики, а сверхразрешённые данные формируются непосредственно при регистрации сигнала. Поэтому STED не требует обязательной постобработки данных (хотя она, разумеется, возможна). В отличие от этого, PALM/STORM, а также SIM требуют сложной обработки данных для получения информативного изображения.
Рис. 2. Диаграмма Яблонского для процесса STED в флуоресцентной молекуле. После оптического возбуждения (1) из основного состояния S₀ в первое возбуждённое состояние S₁ молекула обычно возвращается в основное состояние с испусканием фотона (3). Воздействие STED-фотонов переводит возбуждённую молекулу обратно в основное состояние без испускания флуоресценции (2).
Пучок в форме «пончика» — ключ к сверхразрешению
Однако если STED-пучок имеет ту же форму и покрывает ту же область, что и возбуждающий пучок, все возбуждённые флуорофоры возвращаются в основное состояние, и выигрыша в разрешении не происходит. Преодоление дифракционного предела становится возможным только при модификации STED-пучка.
Интенсивность STED-лазера формируется таким образом, что в центре она равна нулю — фактически в пучке появляется «дырка», и он приобретает форму бублика / поника (donut). В результате все флуорофоры на периферии фокального пятна деактивируются, тогда как молекулы в центральной области, где отсутствует STED-свет, продолжают нормально флуоресцировать. В итоге возникает излучающий фокус, существенно меньший дифракционного предела.
Можно возразить, что сам «бублик» также ограничен дифракцией — и это верно. Однако здесь вступает в игру второй эффект: насыщение STED-процесса. Молекулу невозможно «выключить сильнее», чем она уже «выключена». Именно эта нелинейность принципиально разрушает дифракционный предел, ограничивая область допустимой флуоресценции исключительно центральной частью бублика.
А что насчёт детектирования? Оно ведь тоже дифракционно ограничено. Это так. Но поскольку флуоресценция возможна только в очень малой области, мы точно знаем, что все зарегистрированные фотоны исходят именно оттуда. А так как положение этого участка строго определяется положением сканера, локализация молекулы известна с высокой точностью — даже если её изображение на детекторе снова оказывается дифракционно ограниченным.
Рис. 3. STED-бублик: STED-пучок, смещённый в красную область спектра, удерживает молекулы в основном состоянии («выкл.»). Только молекулы в центре, где интенсивность равна нулю, испускают фотоны, и вся регистрируемая флуоресценция исходит из этой субдифракционной области.
Рис. 4. Полное изображение формируется путём сканирования совмещённого фокуса обоих пучков по образцу. В каждой точке регистрируется сигнал исключительно из центральной области фокуса.
Почему это не молекулярное разрешение
В целом, чем выше мощность STED-лазера, тем выше достигаемое разрешение. Однако эта зависимость нелинейна: уже сравнительно небольшие мощности STED-пучка приводят к значительному улучшению разрешения. Теоретически дальнейшее увеличение мощности может привести к бесконечно малой области флуоресценции, что означало бы возможность достижения разрешения в единицы нанометров.
На практике же такой подход быстро сталкивается с ограничениями: при высоких мощностях лазера возникают нежелательные эффекты, прежде всего фотообесцвечивание. В реальных биологических образцах STED-микроскопы обычно обеспечивают разрешение порядка 30 нм.
Это значение может быть дополнительно улучшено — до менее чем 20 нм — при использовании продвинутых модулей, таких как FLEXPOSURE и TIMEBOW от abberior.
FLEXPOSURE реализует адаптивное освещение, интеллектуально снижая световую нагрузку на образец за счёт отключения лазеров в областях, где отсутствуют структуры. Сэкономленный «фотонный бюджет» можно направить либо на повышение разрешения, либо на увеличение числа кадров в тайм-лапс-экспериментах.
TIMEBOW предоставляет информацию о времени жизни флуоресценции. Поскольку время жизни сигнала зависит от расстояния до центра STED-бублика (оно уменьшается с ростом степени деактивации), этот параметр кодирует пространственную информацию, которая может быть использована для дальнейшего повышения разрешения.
В итоге, секрет STED сводится к относительно простому приёму: добавлению второго, бубликообразного лазерного пучка, который деактивирует флуорофоры и сужает область допустимой флуоресценции до размеров, меньших дифракционного предела.
Рис. 5. Результат изящного физического приёма: STED (справа) преодолевает дифракционный барьер и позволяет получать сверхразрешённые изображения. Слева конфокальное изображение. Показано трёхцветное изображение первичных нейронов гиппокампа, выявляющее периодичность βII-спектрина (~190 нм) вдоль дистальных аксонов (зелёный, abberior STAR 635P), различимую только в STED-режиме. Дополнительно отмечены структуры: Bassoon (красный, abberior STAR 580), актиновый цитоскелет (синий, фаллоидин, Oregon Green 488). Образец предоставлен Элизой Д’Эсте, Институт биофизической химии им. Макса Планка, Гёттинген, Германия.
STED — это больше, чем кажется на первый взгляд
Создание STED-микроскопа, способного обеспечивать максимальное разрешение при минимальной световой нагрузке на образец, требует сложных инженерных решений как на аппаратном, так и на программном уровне — и этим специалисты abberior по праву гордятся. Одним из ключевых условий является, например, истинный ноль интенсивности в центре STED-бублика, а также возможность гибкой подстройки размера пучка под заднюю апертуру различных объективов. Не каждый STED-микроскоп способен обеспечить такие параметры.
