Арт. STEDYCON 2
Микроскопия сверхвысокого разрешения со стимулированным подавлением флуоресценции (STED, stimulated emission depletion), также называемой STED-наноскопией, основано на временном подавлении флуорофоров во внешних областях пятна возбуждения. В результате область, из которой молекулы могут испускать флуоресценцию, сжимается до размеров меньше дифракционного предела. В этой схеме STED-луч выполняет роль светового «выключателя». Чтобы эффективно выполнять свою функцию, он должен иметь строго определённую форму: нулевая интенсивность в центре и высокая интенсивность по окружности. Да, именно — аппетитный бублик!
Приготовить настоящий бублик на кухне несложно (при наличии хорошего рецепта): достаточно формы для выпечки, которая задаёт нужную геометрию. Но как заставить световой пучок принять форму бублика? Очевидно, что формы для света не существует. Или всё-таки существует?
О пиках и впадинах
Прежде чем ответить на этот вопрос, сделаем шаг назад и вспомним физические свойства света. Как известно, свет распространяется в виде волны, и, как любую волну, его можно описать длиной волны или частотой, амплитудой, направлением распространения и фазой. Здесь нас будет интересовать именно фаза.
Фаза описывает, где и когда волна находится в определённом состоянии (например, в максимуме или минимуме). Фазу удобно измерять в долях длины волны λ.
Когда две волны встречаются, разность их фаз определяет амплитуду результирующей волны. Если, например, две интерферирующие волны полностью совпадают по фазе — то есть их «пики» и «впадины» точно совпадают, — их амплитуды складываются, и возникает конструктивная интерференция. Если же одна из волн сдвинута на половину длины волны (λ/2), «пики» одной волны совпадают с «впадинами» другой, и возникает деструктивная интерференция. В частном случае, когда амплитуды волн одинаковы, деструктивная интерференция будет полной: света не остаётся, интенсивность равна нулю.
Рис. 1. Когда волны находятся в фазе (максимум к максимуму, минимум к минимуму), они интерферируют конструктивно. Волны одинаковой частоты и амплитуды, но с фазовым сдвигом ровно в половину длины волны (λ/2), интерферируют деструктивно и взаимно гасятся.
Формирование STED-бублика
Создание бубликоподобного STED-луча сводится к умелому управлению фазой светового пучка таким образом, чтобы в фокусе возникала полная деструктивная интерференция.
Удобный способ изменить фазу луча — поместить на его пути фазовую пластину, то есть элемент, замедляющий прохождение световой волны. В простейшем виде это может быть плоская стеклянная пластинка, через которую свет проходит дольше, чем через слой воздуха той же толщины.
Таким образом, фазовая пластина позволяет изменить фазу STED-луча. Но превращает ли это пучок в бублик? Пока нет. Ведь для деструктивной интерференции необходима разность фаз, а равномерный фазовый сдвиг всего волнового фронта ничего не даёт.
Следовательно, нужно изменить фазу не всего фронта целиком, а только его части. Самый простой способ — использовать фазовую пластину, перекрывающую лишь половину пучка. Подбирая толщину стекла, можно ввести фазовый сдвиг ровно в половину длины волны между противоположными сторонами пучка. Когда волны с обеих сторон сходятся в фокальной плоскости, это приводит к полной деструктивной интерференции вдоль линии, параллельной границе фазовой пластины. Но постойте — нам ведь нужен бублик, а не булочка для хот-дога, верно?
На пути к бублику
Чтобы перейти от линии к бублику, лучше всего использовать вихревую фазовую пластину (vortex phase plate). По сути, это осесимметричный вариант «хот-дожной» фазовой пластины. Она напоминает миниатюрную винтовую лестницу с толщиной, возрастающей по спирали, и вводит спиральный фазовый сдвиг от 0 до одной полной длины волны по всему волновому фронту.
Любые две точки пучка, расположенные на противоположных сторонах, оказываются сдвинутыми по фазе ровно на половину длины волны и взаимно гасятся в фокусе. В результате формируется идеальный STED-бублик…
…но только в двух измерениях. Разрешение вдоль оптической оси в такой конфигурации по-прежнему ограничено дифракцией, поскольку бублик существует лишь в фокальной плоскости.
Рис. 2. Влияние фазового сдвига на распределение интенсивности в фокусе: когда все волны находятся в фазе, в фокусе наблюдается конструктивная интерференция (слева). Фазовая пластина, перекрывающая половину пучка и вводящая фазовый сдвиг ровно λ/2, приводит к появлению центральной линии деструктивной интерференции (справа).
Сверхразрешение по оси z
К счастью, существуют и другие способы конструирования фазовых пластин для управления формой светового пучка. В случае 3D-STED фазовая пластина имеет кольцевую форму: внешнее кольцо толще центрального диска и вводит фазовый сдвиг ровно в половину длины волны между ними.
Свет, проходящий через эти две области, формирует в фокальной плоскости две различные, но точно совмещённые функции рассеяния (PSF, point spread function): более крупную — от центрального диска и более компактную — от внешнего кольца. Благодаря фазовому сдвигу между ними меньшая PSF как бы «пробивает дырку» в большей.
Так формируется трёхмерный STED-бублик — точнее, полая световая сфера с нулевой интенсивностью в центре, которая сжимает эффективное пятно возбуждения до субдифракционных размеров во всех трёх измерениях. 3D-STED достигнут! И на этом месте в сказке все микроскописты жили бы долго и счастливо.
Рис. 3. Разные фазовые пластины — разные результаты: одноступенчатая фазовая пластина создаёт центральную линию деструктивной интерференции, вихревая фазовая пластина формирует бублик. Для 3D-STED используется кольцевая фазовая пластина, вводящая фазовый сдвиг между внутренними и внешними волнами STED-луча. Из-за большей числовой апертуры внешние волны формируют меньшую PSF, расположенную в центре большей PSF, создаваемой внутренними волнами. В области перекрытия обе PSF взаимно гасятся, формируя трёхмерный бублик.
Но в реальности всё сложнее. Получение изотропного разрешения во всех трёх измерениях с использованием фазовых пластин остаётся серьёзной задачей. Кроме того, аберрации быстро «заполняют» центр 3D-бублика STED-светом, что приводит к потере флуоресцентного сигнала. Наконец, фазовые пластины не адаптируются к различным диаметрам задней апертуры объективов.
