Микроскопия живых клеток позволяет лучше понимать фундаментальную природу клеток, их организацию. Развитие разнообразных технологий микроскопии, таких как конфокальная микроскопия, позволяет получать изображения большого спектра событий на клеточном уровне с высоким пространственным и временным разрешением. Компания Confocal.nl представляет новую возможность для исследователей-биологов проводить конфокальные эксперименты на широкопольном микроскопе, используя оптические модули от Confocal.nl в сочетании с решением Inscoper для управления системой для микроскопии.
Конфокальная микроскопия для визуализации живых клеток
Визуализация живых клеток используется учеными в весьма широком круге областей исследований, таких как биология развития, нейробиология и клеточная биология (Jensen, 2013). Визуализация обычно используется для совершенствования и углубления знаний о биологических функциях посредством изучения клеточной и внутриклеточной динамики. Однако, чтобы гарантировать надежность этих экспериментов, необходимо учитывать ряд ограничений. Фотообесцвечивание и фототоксичность — серьёзные проблемы, нарушающие целостность клеток и мешающие обнаружению флуоресцентного сигнала. Чтобы предотвратить их появление, важно максимально ограничить длительное время экспозиции и высокоинтенсивный возбуждающий свет. Для конфокальная микроскопии может использоваться быстрый сканер для визуализации живых клеток (Axelrod et al., 1976; Bayguinov et al., 2018). Она дает исследователям возможность реализовать трехмерную визуализацию живых клеток и улучшить пространственное разрешение их изображений, увеличивая соотношение сигнал/шум. Из-за высокой интенсивности лазерных лучей в конфокальной микроскопии требуется идеальная синхронизация и управление всеми устройствами микроскопа, чтобы гарантировать минимальное время экспозиции биологических образцов.
Inscoper — решение для оптимизации работы микроскопа
Inscoper — это полноценное решение для регистрации изображений при работе с современными видеомикроскопами и флуоресценцией, используемыми в биологических науках. Включая в себя специально разработанное устройство, решение Inscoper обеспечивает новые возможности для пользователей благодаря улучшенным техническим характеристикам, системной интеграции и простоте в использовании (рис.1).
Рисунок 1: Вид ПО Inscoper. Сбор многомерных данных и последовательности регистрации планируются с помощью удобного интерфейса программного обеспечения Inscoper. Предварительный просмотр образца в режиме реального времени можно наблюдать в левой части экрана. Здесь выбраны измерения в режимах «Многоканальный режим» и «Z-стек».
Некоторые пользователи считают, что скорость получения изображений определяется только частотой кадров камеры и медленным временем отклика микроскопических устройств. На самом деле, задержка, создаваемая программным обеспечением для обработки изображений, является основным фактором, который уменьшает время отклика устройств, тем самым замедляя получение изображений. Ядро технологии Inscoper спроектировано таким образом, чтобы устранять любые программные задержки, в результате чего частота кадров увеличивается в три раза по сравнению с традиционными подходами для получения многомерной визуализации (время, XYZ, каналы).
Продукты Confocal.nl для микроскопии сверхвысокого разрешения и быстрого сканирования
Недавно компания Inscoper интегрировала свое решение в две конфокальные системы от Confocal.nl (Амстердам, Нидерланды): NL5 (A, рис.2) и RCM2 (B, рис.2). Confocal.nl разработала подходы конфокальной микроскопии, адаптированные для визуализации живых клеток с использованием низкой интенсивности лазерного излучения. Это предотвращает фототоксичность, разрушающую образцы, и фотообесцвечивание флуорохромов. Эти инновационные системы позволяют исследователям легко отслеживать долгосрочные биологические явления с высокой скоростью получения изображений, высоким пространственным разрешением без внесения изменений в образец.
Рисунок 2: Системы NL5 (A) и RCM2 (B) от Confocal.nl для конфокальной микроскопии, контролируемые с помощью Inscoper.
NL5 — это конфокальная система Confocal.nl с быстрым линейным сканированием на основе камеры, адаптированная для 3D визуализации живых клеток с высокой чувствительностью (до 95% квантовой эффективности) и высоким разрешением (170 нм после деконволюции, Таблица 1). NL5 может преобразовать эпифлуоресцентный микроскоп в быстросканирующий конфокальный. Он содержит щелевое отверстие, которое увеличивает скорость получения изображения за счет сканирования линий вместо отдельных точек (25 кадров в секунду). NL5 может уменьшить время экспозиции вовремя и предотвратить фототоксичность и обесцвечивание. Таким образом, NL5 - экономически эффективное решение, которое может быть подключено к любому исследовательскому микроскопу через интерфейс C-mount.
Таблица 1. Сравнение систем NL5 и RCM2 от Confocal.nl
|
|
NL5 |
RCM2 |
|
Детектор |
Камера |
Камера |
|
Разрешение с учётом деконволюции |
170 нм |
120 нм |
|
Чувствительность (% квантовой эффективности) |
До 95% КЭ |
До 95% КЭ |
|
Скорость |
25 к/с при полном разрешении |
2 к/с при 512x512 пикс |
|
Поле обзора |
330x330 мкм (40x) |
220х220 мкм (40x) |
|
Оптимизировано для |
40-100х |
40х (с высокой NA), 60х, 100х |
|
Режим ByPass |
Да (моторизованный) |
Да |
RCM2 - это конфокальный микроскоп Confocal.nl с двунаправленным рексканированием (RCM) на основе камеры. Он представляет собой стандартный конфокальный микроскоп, дополненный оптическим блоком повторного сканирования, который проецирует изображение непосредственно на камеру (De Luca et al., 2013). После деконволюции разрешение увеличивается до 120 нм (Таблица 1).
В представленном примере использовался микроскоп Nikon Ti2 Eclipse с объективом Plan Apo λ 60x 1.4 NA с масляной иммерсией (MRD01605, Nikon), CMOS камера Orca Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Япония), а источниками света служили лазер Oxxius (L4Cc; Oxxius, Ланнион, Франция) для конфокальной визуализации и система освещения от Lumencor (Spectra, Lumencor, Beaverton, США) для визуализации в режиме "ByPass".
Применение в биологии
Сначала NL5 от Confocal.nl использовали для получения изображений ядер из клеток HeLa, меченных Hoechst. Изображения в режиме "ByPass" и конфокальном режиме были получены с использованием одного и того же микроскопа и камеры (рис. 3). Конфокальные изображения показали лучшее разрешение по оси x-y по сравнению с ByPass режимом. Например, уплотненная ДНК (более яркие пятна, наблюдаемые в ядрах) демонстрирует больше деталей при использовании NL5 в конфокальном режиме с увеличением отношения сигнал/шум (SNR). Важно отметить, что этот результат может быть улучшен при использовании протокола деконволюции (разрешение после деконволюции составляет 170 нм).
Рисунок 3: Двухмерная конфокальная визуализация с использованием NL5 (Confocal.nl) с управлением с помощью Inscoper. Справа изображение, полученное в конфокальном режиме, слева изображение, полученное в режиме ByPass. Клетки HeLa, помеченные Hoechst (ядра, серые). Белые стрелки указывают на конденсированный хроматин. Шкала: 10 мкм.
NL5 затем использовался для получения изображения митохондриальных сетей в фиксированных клетках HeLa которые были трансфицированы GFP-слитым митохондриальным белком и меченых Hoechst (рис.4). С использованием Inscoper была выполнена последовательная многомерная визуализация в режиме " Multi-channels" с привязкой к Z-стеку (шаг: 0.5 мкм). И снова, наблюдалось лучшее латеральное разрешение и отношение сигнал/шум (A, рис.4). Трехмерная модель может быть получена с использанием всех Z-стеков с использованием открытого программного обеспечения ImageJ или других. Здесь 3D визуализация была выполнена с помощью плагина ClearVolume для ImageJ (B, рис. 4).
Латеральный вид трехмерной проекции оказался разным для двух режимов (C, рис. 4). Действительно, разрешение по оси z оказалось лучше при использовании конфокального режима по сравнению с ByPass. Например, форма ядер выглядела более четкой без размытой диффузии сигнала, наблюдаемой при ByPass. Аналогично, пятна митохондрий выглядели ярче при более высоком отношении сигнал/шум.
Рисунок 4: Трехмерная конфокальная визуализация с использованием NL5 (Confocal.nl) под контролем Inscoper фиксированных клеток HeLa. Результирующие изображения представлены с использованием 2D-максимальной Z-проекции (A), 3D-проекции с верхним (B) и боковым (C) видами с использованием плагина CleanVolume программного обеспечения ImageJ. Белые стрелки обозначают ориентацию осей x, y, z. Масштабная шкала (2D-изображение): 10 мкм. Размеры (3D-проекции): 31x33x20 мкм.
Кроме того, NL5 Confocal.nl может выполнять съемку в режиме тайм-ласпа или скрининг многолуночных планшетов. Его также можно использовать в сочетании с другими методами микроскопии, требующими быстрой визуализации, например, FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания).
Во втором случае наблюдались клетки BPAE, меченные MitoTracker и Hoechst (митохондрии и ядра, соответственно) с помощью системы RCM2 от Confocal.nl. Inscoper полностью управляет всеми устройствами RCM2, за исключением переключателя режимов Confocal/Bypass, который не моторизован. В этой системе переключение происходит вручную с помощью ручки на устройстве перед началом сбора данных. Последовательность сбора данных в основном начинается в режиме Bypass для выбора интересующей области в образце. Затем пользователь может переключиться в RCM режим для получения изображений высокого разрешения.
Под управлением Inscoper, RCM2 удалось получить многомерные изображения митохондриальной сети из клеток BPAE (рис. 5). Более того, с помощью RCM2 можно также реализовать таймлапс, чтобы исследовать с разрешением 170 нм (120 нм после деконволюции) динамические биологические процессы, такие как митохондриальная сеть (генезис, слияние/деление/перемещение, и т.п.) или ремоделирование цитоскелета (микротрубочки или полимеризация/деполимеризация актина).
Рисунок 5: Визуализация митохондриальной сети с использованием RCM2 (Confocal.nl) под контролем Inscoper. Область внутри квадрата с пунктирной линией представлена в левом нижнем углу изображения с увеличением. Деконволюции не проводилось. Шкала: 20 мкм (большое изображение) и 5 мкм (увеличенное изображение).
Заключение
Две системы от Confocal.nl (NL5 и RCM2) были добавлены в список оборудования, полностью совместимого с Inscoper. Оба устройства конфокальной микроскопии оказались идеально подходящими для визуализации живых клеток благодаря низкой фототоксичности и высокой чувствительности (высокий SNR). Таким образом, Inscoper и устройства от Confocal.nl совместимы с любым флуоресцентным микроскопом, что делает их универсальным решением.
