Арт. FQM-ARGO-PWR
Контекст
Хотя проблема оценки производительности и контроля качества флуоресцентных микроскопов стала предметом обсуждения более пятнадцати лет назад в академических лабораториях и национальных регулирующих агентствах, она до сих пор все еще актуальна.
В связи с повышением сложности конструкции используемых приборов для конфокальной и высокоточной широкопольной флуоресцентной микроскопии национальные метрологические институты, производители микроскопов и микробиологические центры совсем недавно были вовлечены в разработку, изготовление и тестирование различных инструментов, как аппаратных, так и программных для оценки многочисленных аспектов работы флуоресцентных микроскопов.
С одной стороны, стало очевидно, что контроль качества флуоресцентных микроскопов важен, так как они требуют оплаты технического сервиса для конечных пользователей микроскопов. В этом смысле, пользователи должны быть уверены до определенного уровня в качестве работы их микроскопа. Быстрая идентификация и таким образом решение проблем в работе микроскопа важно, чтобы предотвратить получение недостоверных данных и свести к минимуму время простоя оборудования. Вот почему микробиологические центры обычно тратят десятки тысяч евро в год на содержание их систем для микроскопии.
С другой стороны, для производителей микроскопов обслуживание не так эффективно, как могло бы быть по двум основным причинам. Во-первых, в среднем вмешательство в техническое обслуживание более двух раз не оправдано, так как основано на неправильной (человеческой неверной интерпретации) диагностике на месте работы системы, пока она работает правильно. Во-вторых, когда система неисправна для выявления и устранения проблемы может потребоваться несколько вмешательств. Зная заранее, что существует проблема с микроскопом, это позволяет оптимизировать обслуживание, если оно является необходимым. Оно сократило бы время обслуживания и увеличило бы доступ к технике для других систем/объектов.
Для обоих этих участников – пользователей и производителей микроскопов - может появиться беспроигрышная возможность, если инструмент оценки и мониторинга, одобренный обеими сторона, позволил бы быстро и просто оценить большинство характеристик флуоресцентного микроскопа. Таким образом, микробиологические центры получат гарантию, что они обеспечивают лучший сервис, так как конечные пользователи получают надежные данные, а производители микроскопов сократят время на техническое обслуживание и улучшат свои знания о причине неисправности, которую они могли бы исправить. Кроме того, после установки микроскопа или его технического обслуживания обе стороны могут проверить работоспособность системы, которая больше не основывается на субъективном изображении биологического образца, а имеет объективные и количественные параметры. Это был бы огромный шаг к контролю качества флуоресцентных микроскопов.
Принимая во внимание важность этого вопроса, компания Argolight работала над созданием нового инструмента для оценки эффективности и мониторинга флуоресцентного микроскопа. Этот инструмент, во-первых, направлен на проверку системы в момент времени t0 (после первоначальной установки и/или технического обслуживания), во-вторых, для контроля производительности системы с течением времени и, в-третьих, для обнаружения любой неисправности системы.
Предметное стекло для тестирования
Рис. 1 Предметное стекло (A) с флуоресцентными узорами (B)
|
Устройство – предметное стекло называемое слайд, состоит из нестандартной стеклянной подложки, установленной на стальной носитель (рис. 1А). Носитель имеет те же размеры, что и стандартное предметное стекло для микроскопа. Различные флуоресцентные узоры (рис. 1В) нанесены внутри стекла, на глубине соизмеримой с наличием покровного стекла микроскопа. Эти узоры также демонстрируют контраст в ярких и темных поля, DIC (дифференциальный интерференционный контраст) и фазовый контраст. Каждый флуоресцентный рисунок предназначен для одной или нескольких оценок эффективности флуоресцентного микроскопа. По меньшей мере слайд позволяет оценить и контролировать следующие характеристики флуоресцентного микроскопа (конфокальный, вращающийся диск и широкое поле) – равномерность освещения, искажение поля зрения, парцентральность, парфокальность, определение оптической оси, цветность, хроматические боковые сдвиги, проблемы совместной локализации, точность перемещения сцены, отклик интенсивности системы, спектральный отклик системы, боковую разрешающую способность, настройку объектива, трехмерную (3D) реконструкцию, точность, расстояния в XY и Z осях и производительность сканирования. |
Спектральные особенности
Флуоресцентные узоры обладают следующими спектральными особенности флуоресценции. Возбуждение - диапазон возбуждения от 300 до 650 нм, эффективность возбуждения максимальная около 340 нм и снижается по мере приближения к красным длинам волн. Эмиссия - это континуум, начинающийся немного дальше чем длина волны возбуждения и до 800 нм. Срок службы - с использованием FLIM (флуоресцентная микроскопия с визуализацией времени жизни флуоресценции) были измерены две основные компоненты затухания (0,25 ± 0,05) нс и (2,50 ± 0,50) нс. Фотостабильность – интенсивность флуоресцентных узоров может снижаться, но это снижение является временным. Интенсивность флуоресценции восстанавливается до своего исходного значения через некоторое время. Время восстановления зависит от условий облучения (мощность излучения, длина волны, размер пикселя, время экспозиции).
Примеры оценки производительности
Рис. 2: Конфокальные изображения (объектив план-апохромат 63 × / 1.4) матрицы колец для трех разных каналов (DAPI, A; GFP, B; и Texas Red, C) и суперпозиция этих каналов (D) , (E) Вставка: увеличение одного кольца для трех каналов и их наложение. Боковое смещение между тремя каналами для двух колец изображения, одно внизу слева (F), другое вверху справа (G).
 Рис. 3: Конфокальные изображения (объектив 40 × / 1,3, λexc = 405 нм, Δλem = 410–605 нм) «пересекающаяся лестница» с шагом 2 мкм в хороших условиях (A) и с частично вставленным DIC слайдом (B) , 3D реконструкция лестницы (С).
|
Тесты, которые могут быть выполнены с использованием слайда достаточно многочисленны, чтобы каждый из них подробно описать в рамках настоящей статьи. Поэтому мы ограничимся тремя примерами, тем не менее иллюстрирующими потенциал использования этого инструмента. Боковые хроматические сдвиги Благодаря тому, что флуоресцентные узоры могут быть возбуждены излучением от ультрафиолетового до красного спектра, могут быть измерены боковые хроматические сдвиги между различными каналами. Матрица колец размером 1 мм² (синяя вставка на рис. 1B) позволяет делать это не только в центре поля зрения с бусинкой в центре, но и целиком. Рисунки 2A-D изображают матрицу колец, полученную с тремя разными каналами (DAPI, GFP и Texas Red), и наложение этих каналов, соответственно. На рисунках 2F и 2G представлены профили интенсивности для трех каналов для двух колец изображения, одно внизу слева и другое справа вверху, соответственно. Видно, что боковой сдвиг между тремя каналами составляет не более 130 нм, меньше бокового разрешения системы (здесь 200 нм) для настоящего объектива Plan-Apochromat 63 ×/1.4. Объектив Plan-Apochromat означает, что боковое смещение между четырьмя разными цветами (темно-синий, синий, зеленый и красный) должно быть меньше бокового разрешения системы. Результаты показаны на Рисунке 2 в соответствии со спецификациями производителя для трех настоящих каналов. Проблемы настройки объектива и 3D точность реконструкции
Интересный аспект этой технологии заключается в его способности создавать узоры разной длины на разной глубине предметного стекла (слайда). Разработаны четыре 3D-модели (красная вставка в рисунке 1B), состоящие из колец на разной глубине с разными шагами (5, 2, 0.5 и 0.2 мкм), окруженных четырьмя колоннами с двумя «пересекающимися лестницами». На одном двумерном изображении имеется доступ к распространению света в 3D от колец на разных плоскостях, которое позволяет получить представление о проблемах не в фокусе объектива. Было получено изображение «пересекающейся лестницы» с шагом 2 мкм с тем же объективом в хороших условиях (рис. 3А) и с DIC слайдером, частично вставленным в оптический путь для моделирования проблемы (рис. 3В). На изображении, полученном с частично вставленным DIC слайдером (рис. 3B), видно, что свет распространяемый кольцами в фокусе, выглядит правильно, в то время как свет распространяемый кольцами вне фокуса не имеет круглой симметрии, в отличие от рисунка 3А, что свидетельствует о наличии этой проблемы. |
Это простой и быстрый способ проверить оптическое качество системы. Помимо этого конкретного случая, также можно наблюдать с помощью этого метода поврежден ли объектив микроскопа или присутствует на нем пыль или масло.
Такой шаблон также может быть использован для оценки точности его реконструкции в 3D, как это показано на рисунке 3C. На этом рисунке ясно видно, что реконструкция является точной, и что Z-расстояния ожидаемые.
Отклик интенсивности системы
Эта технология также позволяет контролировать интенсивность флуоресценции образцов, до 16 хорошо различимых уровней интенсивности после гарантированной линейной эволюции. Узор состоит из 16 квадратов с различной интенсивностью (зеленая вставка на рис. 1B). Может использоваться для характеристики интенсивности отклика системы в условия линейности, чувствительности и предела насыщенности.
Рис. 4: (A) Широкополосное флуоресцентное изображение (объектив 40 × / 0,95, канал GFP, время воздействия 1 секунда) 16 квадратов, имеющих разную интенсивность. (B) Эволюция средней интенсивности в каждом квадрате от номера квадрата. Кривая линейной регрессии имеет коэффициент Пирсона лучше 0.99, что свидетельствует о хорошей линейности отклика реальной камеры. (C) Снимок экрана интерфейса Daybook-Z.
На рисунке 4А показано изображение этих 16 квадратов. Средняя интенсивность каждого квадрата была измерена и построена на графике в зависимости от номера квадрата. Эволюция уровней интенсивности следует линейному тренду с коэффициентом корреляции Пирсона лучше 0,99, что свидетельствует о хорошем линейном отклике реальной камеры (рис. 4В). Этот анализ был проведен с помощью Daybook-Z - специализированного программного обеспечения для анализа слайда Argo-Z менее чем за минуту. Кроме интенсивности отклика системы Daybook-Z также позволяет извлекать из изображений подходящих узоров однородность освещения, искажения поля, пространственную совместную локализацию, боковую разрешающую способность, смещение сцены, точность и спектральный отклик системы (рис. 4С).
Заключение
Впервые, насколько нам известно, появилась технология, которая позволяет оценивать и контролировать большинство характеристик флуоресцентных микроскопов по той же шкале времени, что и их время жизни. Рассмотренный в этой статье слайд удовлетворяет требованиям, перечисленным широким сообществом флуоресцентных микроскопистов и национальными метрологическими институтами. Это огромный шаг к контролю качества флуоресцентных микроскопов. Благодаря тому, что все флуоресцентные узоры точно расположены можно полностью автоматизировать процесс оценки, во-первых, для получения изображений, во-вторых, для анализа с помощью специальных алгоритмов, и в-третьих, для создания документов управления качеством, в том числе числовых данных, графиков, отчетов и т. д.
