Контроль температуры в системах световой микроскопии – проблемы и решения

Компания Interherence стремится показать, что терморегулирование в высокочувствительной микроскопии не является тривиальным, если вы заботитесь о температуре непосредственно в поле зрения микроскопа (что Вас должно волновать). Interherence надеется убедить Вас, что стоит уделять больше внимания контролю температуры. Вы будете вознаграждены надежными и воспроизводимыми данными.

Все процессы в природе зависят от температуры. Например, старое эмпирическое правило химии гласит, что скорость химических реакций будет удваиваться с каждым повышением температуры на 10 °C. Поэтому важно всегда проводить эксперимент при определенной температуре. Полагаться на «лабораторную температуру» - не лучшая идея, потому что это значение сильно меняется между летом и зимой, когда кондиционер включен и выключен, идет ли горячий воздух из вентилятора большого прибора рядом с вашим экспериментом и т. д.

Эта рекомендация всегда контролировать температуру в ваших экспериментах универсальна, включая эксперименты с визуализацией. Кроме того, имея дело с биологическими образцами, важно учитывать, что живые системы эволюционировали, чтобы функционировать при определенной физиологической температуре, и это температура, при которой они должны изучаться в большинстве случаев. Изменение всего на несколько градусов Цельсия резко меняет скорость ферментативных реакций, диффузию белка, динамику цитоскелета, текучесть мембран или даже может вызвать необратимые фазовые переходы. Вот почему ваше решение для контроля температуры должно быть более точным!

Рис. 1: Система контроля температуры VAHEAT от Interherence может быть установлена на любой коммерческий микроскоп без каких-либо модификаций.

Проблемы контроля температуры в микроскопии

Какие проблемы связаны с контролем температуры в экспериментах по визуализации?

• Испарение жидких образцов - изменение концентрации среды, конденсация на более холодных поверхностях;
• Температурный дрейф;
• Ограниченный температурный диапазон (макс. 45–55 ° C) и отсутствие возможности быстрого изменения температуры в стандартных системах управления.
• Ухудшение качества изображения или потеря угла TIRF при более высоких температурах.
• Сложность некоторых настроек - несколько контуров обратной связи, необходима особая калибровка температуры.
• Неопределенная температура и градиент в поле зрения - иммерсионный объектив действует как теплоотвод

Первой проблемой является испарение, которое вызывает проблемы из-за изменения концентрации среды, в которой инкубируется образец. При работе с прямым микроскопом также возникающая в результате конденсация испарившейся жидкости может затруднять получение изображений. Есть несколько способов минимизировать испарение. Во-первых, убедитесь, что простых решений, таких как парафильм или покровное стекло с краями, смазанными вазелином, недостаточно. Другое простое решение - покрыть среду слоем минерального или силиконового масла, что является типичным подходом при культивировании эмбрионов млекопитающих или органоидов.

К другим, более сложным способам предотвращения испарения, относится нагретая крышка камеры для визуализации, имеющая температуру на несколько градусов Цельсия выше температуры образца. Недостатком подогреваемой крышки является то, что к образцу труднее получить доступ для таких манипуляций, как добавление ингибиторов или витальных красителей. Второй подход заключается в использовании микрофлюидики, которая, помимо предотвращения испарения, обеспечивает также перфузию вашего образца свежей средой. А дополнительное преимущество использования микрофлюидики заключается в том, что она сводит к минимуму экспериментальный объем и экономит на дорогостоящих реагентах или потенциально ценных образцах. Начало работы с микрофлюидикой для получения биологических изображений не должно быть дорогостоящим. Можно начать с 3D-печатных форм на стандартном 3D-принтере и шприцевого насоса.

Температурный дрейф - это проблема, возникающая из-за температурных градиентов в вашей системе визуализации, либо из-за медленного температурного уравновешивания всего микроскопа, либо из-за эффектов, связанных с иммерсионным объективом. В некоторых случаях помогают системы автофокусировки, но лучше всего сводить к минимуму колебания температуры и избегать ситуации, когда Вы вставляете холодный образец в нагретую камеру микроскопа. Температурный дрейф чаще всего происходит в системах, которые медленно уравновешиваются, например, в больших боксах, где тепло передается только через нагретый воздух. Дрейф в первые 30–60 мин эксперимента является обычным явлением. Эта проблема не возникает при использовании системы VAHEAT, которую можно использовать без проблем при отсутствии аппаратной автофокусировки.

Следующая проблема заключается в том, что стандартные флуоресцентные микроскопы в вашей системе визуализации не предназначены для получения изображений при экстремальных температурах (с точки зрения биологии) от 50 до 100 °C. Но для наблюдения за термофильными прокариотами, плавлением ДНК, денатурацией белка и другими экспериментами необходимо иногда выдерживать образец при этих температурах в течение многих часов. Основная проблема в том, что стандартные объективы не предназначены для работы при таких температурах. Как правило, они рассчитаны на температуру 23–37 °C и длительный нагрев, а также частые колебания температуры, например, при работе с системой нагрева объектива, может повредить их, поскольку тепловое напряжение на различные компоненты объектива может вызвать смещение его оптических компонентов внутри корпуса или индуцированное напряжением двулучепреломление. Многие исследователи предпочитают использовать только объективы не требующие иммерсии, что снижает разрешение. В качестве альтернативы они нагревают только образец через вставку предметного столика, но затем снова возникает проблема градиента температуры.

Связанный с этим физический эффект, который не следует игнорировать, - это изменение показателя преломления вашего иммерсионного масла в зависимости от температуры (около 0.004 / 10 ° C), потенциально излишне ухудшающее качество изображения. Поэтому Вам следует обратиться к производителю иммерсионного материала для получения специального иммерсионного материала, который имеет правильный RI (например, 1.515) при желаемой температуре изображения, если Вы планируете получать изображения при температуре выше 37 °C. Такие высокотемпературные масла доступны, например, от Cargille.

Последний пункт очень актуален для получения изображений с высоким разрешением. При использовании иммерсионных масляных объективов Ваш образец термически напрямую связан с объективом и корпусом микроскопа, который обычно имеет комнатную температуру. Это вызывает постоянный тепловой поток и снижение температуры Вашего образца на несколько градусов. Другими словами, если Вы установите регулятор температуры на 37 °C, Ваш образец никогда не будет инкубирован при 37 ° C и будет находиться в температурном градиенте. Это явление было измерено на стандартном конфокальном микроскопе с вращающимся диском, используя устройство контроля температуры VAHEAT в качестве термометра и нагревателя непосредственно в образце (рис. 2). 

Рис. 2: a) Измерение эффекта теплоотвода при использовании масляного иммерсионного объектива 63x / 1.4 NA. Большой бокс для контроля параметров окружающей среды находится в равновесии при 37 ° C, этого недостаточно для поддержания температуры образца 37 °C. Когда иммерсионный объектив касается образца, температура снижается как минимум на 3 °C и никогда не возвращается обратно к 37 °C, поскольку объектив соединен с корпусом микроскопа, который находится вне камеры при комнатной температуре. Система VAHEAT использовалась для измерения падения температуры и компенсации охлаждающего эффекта объектива. При включенном VAHEAT эффект теплоотвода присутствует только в течение первых 10 с, когда температура падает до 36.2 °C и после этого ОС прибора корректирует ее. Таким образом, образец всегда находится при температуре 37 °C. b) Конфокальная система визуализации с вращающимся диском в Центре оптической визуализации в Эрлангене, где были получены данные.

Стандартный подход к предотвращению падения температуры в поле зрения - использование обогревателей объектива. Однако такой подход часто приводит к ухудшению качества изображения при работе с объективами с высокой числовой апертурой (числовая апертура> 1). Обычно они предназначены для работы при комнатной температуре, некоторые рассчитаны на работу при 37 °C. Однако если Вы измените их температуру и выйдете за пределы указанного диапазона, оптические характеристики ухудшатся. В системах TIRF это может даже привести к потере критического угла.

Данная проблема освещается в статье Microscopy U: 

«Среди наиболее важных факторов, связанных с колебаниями температуры, можно выделить то, что предметный столик, рама и объективы микроскопа могут действовать как теплоотводы и противодействовать усилиям системы нагрева образца. Эта проблема усугубляется при использовании иммерсионных объективов, поскольку оптическая связующая среда, которой может быть масло, глицерин или вода, имеет гораздо более высокую теплопроводность, чем воздух. В сочетании с непосредственной близостью объективов с высокой числовой апертурой к образцу, а также с тепловой нагрузкой на сам объектив, вся система может быть быстро лишена тепла, если объектив не контролируется термически. В случае статических камер, описанных выше, область непосредственно под объективом часто на 5 °C холоднее, чем остальная часть камеры для образца ».

Традиционные решения для контроля температуры в микроскопии

Есть несколько традиционных решений для контроля параметров окружающей среды. Не существует единого устройства, которое идеально подходило бы для каждого эксперимента, чувствительного к температуре. Вы должны выбрать, исходя из вашего наиболее распространенного применения, или приобрести несколько устройств для одной системы микроскопии. Иногда их можно выгодно сочетать вместе.

1) Большие боксы для поддержания определенного микроклимата вокруг микроскопа.

Недостатки заключаются в том, что температура измеряется далеко от образца, и изменения температуры могут быть очень медленными. Уравновешивание параметров среды вокруг микроскопа в боксе занимает несколько часов, поэтому на такой системе невозможно проводить эксперименты с быстрым изменением температуры (такие как быстрый тепловой шок при одновременной визуализации образца). Медленное уравновешивание также означает более заметный температурный дрейф по сравнению с другими устройствами. На практике это означает, что такой микроскоп с боксом часто предназначен для получения изображений только при одной температуре, обычно при 37 °C. Естественно, этот бокс нельзя переносить на другой микроскоп. Преимущество этого решения заключается в том, что некоторые боксы также можно охладить примерно до 10 °C, а затем использовать в сочетании с меньшим нагревательным элементом для достижения температуры ниже температуры окружающей среды.

2) Инкубаторы для столика с подогревом в сочетании с нагревателями объектива.

Это рабочее, но довольно сложное и дорогое решение при использовании иммерсионных масляных объективов. Эта комбинация из-за своей сложности подходит только для опытных пользователей. В зависимости от используемого объектива систему необходимо термически откалибровать, и если она не настроена правильно, две системы обратной связи инкубатора и нагревателя объектива могут мешать друг другу. Такая установка не подходит для измерений с изменением температуры (линейных изменений), только для получения изображений при постоянной температуре. Может возникнуть необходимость изолировать нагретый объектив от револьверной головки, которая снова действует как теплоотвод. Наконец, обогреватели для объективов могут не подходить для температур выше 37 ° C, поскольку объективы не предназначены для работы при этих температурах, как упоминалось ранее. Нагреватели для промышленных объективов часто имеют верхний предел от 50 до 55 ° C, что недостаточно для некоторых приложений. Если инкубатор на предметном столике используется без нагревателя объектива, то в образце возникает температурный градиент, вызванный эффектом теплоотвода.

Когда Вам нужно как эффективное охлаждение, так и обогрев, у Вас есть выбор между устройствами на основе элемента Пельтье и системами на основе потока жидкости.

3) Устройства на основе элемента Пельтье имеют непревзойденный температурный диапазон, они довольно быстрые и точные, но их трудно миниатюризировать, и всегда должен быть теплоотвод, подключенный к элементу, например, большой металлический блок, что может быть непрактично.

4) Устройства на основе потока жидкости довольно универсальны и работают быстро, но не очень удобны для пользователя.

5) Другой вариант - построить контроллер температуры самостоятельно.

Возможно, это того стоит для какого-нибудь универсального приложения, требования которого коммерческие решения не могут удовлетворить. Подход "сделать своими руками" (DIY), как правило, проще в наши дни во времена открытой науки, обучающих видео на YouTube, Arduino и 3D-печати, но если ваша мотивация состоит только в том, чтобы сэкономить деньги, не покупая коммерческую систему, мы бы поспорили, что это не стоит усилий и времени, вложенных в это и конечный результат, вероятно, будет хуже, чем у имеющихся в продаже устройств.

Контроль температуры с высокой точностью с помощью VAHEAT

Описанные выше недостатки различных систем контроля температуры привели Interherence к созданию VAHEAT. Разработчики системы считают, что регулирование температуры должно быть таким же простым, как включение лазера: Вы не должны беспокоиться о калибровке или ухудшении качества изображения. Основной мотивацией было точный контроль фактической температуры образца в поле зрения и разработка устройства, которое подходит для применения в высокочувствительной микроскопии, например, для исследований одиночных молекул и сверхразрешения. Interherence выбрала стратегию нагрева с помощью прозрачного тонкопленочного элемента из оксида индия и олова (ITO) и датчика температуры, встроенного непосредственно в чип. Система также включает покровное стекло, на котором крепится образец, см. рис. 3. Такие решения для нагрева на основе тонкой пленки ITO лучше всего подходят для обеспечения термической однородности, что также подчеркивается в статье Microscopy U.

«Например, камеры с покровными стеклами, которые нагреваются с помощью проводящего покрытия, часто обеспечивают лучшую термическую однородность по всей поверхности стекла, чем камеры, которые нагревают только металл, окружающий периферию покровного стекла. В последнем случае температурные градиенты могут быть значительными. Кроме того, масляные или водяные иммерсионные объективы с высокой числовой апертурой могут действовать как система отводящая тепло от камеры для образца к металлическому объективу, создавая, таким образом, температурный градиент в области иммерсионной среды.»

Рис. 3: а) Компоненты VAHEAT. Устройство состоит из интеллектуальных подложек (1), адаптера микроскопа (2), головки зонда (3) и блока управления (4). b) Интеллектуальные подложки представляют собой функционализированные покровные стекла с прозрачным нагревательным элементом, изготовленным из нанотехнологий, и датчиком температуры непосредственно в поле зрения. c) Тепловое изображение интеллектуальной подложки, когда VAHEAT настроена на 60 ° C, демонстрирует равномерное нагревание всей области.

С VAHEAT температуру можно изменять со скоростью до 100 °C в секунду и стабилизировать с точностью значительно ниже 0.1 °C на уровне установленного значения без каких-либо изменений в вашем микроскопе. Ядром VAHEAT являются интеллектуальные подложки, функционализированные покровные стекла микроскопа, в которых чувствительный датчик температуры и прозрачный нагревательный элемент соединены в активную систему обратной связи. Интеллектуальная подложка считывает и регулирует температуру образца 83 раза в секунду, гарантируя, что она остается точно на заданном значении независимо от условий окружающей среды.

Интеллектуальные подложки Interherence также доступны в версии с резервуаром для жидких образцов. Устройство позволяет программировать произвольные температурные профили аналогично циклеру ПЦР и совместимо с микрофлюидикой. Модульность системы VAHEAT, которая предназначена в основном для использования с объективами с высокой числовой апертурой в конфигурации с инвертированными микроскопами, позволяет устанавливать ее на подавляющем большинстве оптических микроскопов.

Поскольку VAHEAT нагревает только небольшой объем образца, ее можно использовать с объективами с высокой числовой апертурой, требующих иммерсионной жидкости, при высоких температурах. При этом не возникает проблем с перегревом объектива. В одном эксперименте VAHEAT работал при 75.0 °C в контакте с объективом Nikon TIRF 100x / 1,49 NA в течение шести часов. Объектив нагрелся всего на 5–29 °C за первые три часа и достиг температурного равновесия, это демонстрирует тот факт, что с VAHEAT не нужно бояться более высоких экспериментальных температур и что VAHEAT делает нагреватели объективов устаревшими.

Рис. 4 Интеллектуальные подложки, прозрачные нагревающиеся элементы системы VAHEAT, упакованные для транспортировки

Система VAHEAT может помочь всем ученым-биологам в проведении экспериментов, чувствительных к температуре, а для определенных областей, таких как получение изображений термофильных микроорганизмов в реальном времени, определение характеристик термореактивных полимеров или ДНК нанотехнологии, это революционная технология, которая открывает возможность проводить эксперименты, которые раньше были невозможны. Пятьдесят лабораторий и компаний, которые начали использовать устройство Interherence с момента его запуска в 2020 году, работают в различных областях, таких как биофизика одиночных молекул, коллоидная химия и клеточная биология. Они используют VAHEAT для изучения фазовых переходов, жидких кристаллов, липидных слоев и везикул, а также искусственных клеток, экстремофильных микробов, реакцию на тепловой шок или ДНК и белков в растворе.

Сейчас в журналах появляются первые публикации об устройстве Interherence. VAHEAT использовалась для визуализации живых клеток термофильных бактерий лабораторией профессора Гийома Баффу (Институт Френеля) для изучения влияния ограничения на рост бактерий¹. VAHEAT использовался для теплового шока и визуализации живых клеток термочувствительных аллелей дрожжей с помощью конфокальной микроскопии в команде доктора Вольфганга Захариа (Институт биохимии им. Макса Планка) в исследовательском проекте изучения механизмов, управляющих мейозом². VAHEAT также использовался в исследовании с использованием ДНК-оригами для создания искусственной системы транспорта макромолекул в лаборатории профессора Хенрика Дитца (Технический университет Мюнхена). В исследовании использовалась TIRF визуализация одиночных молекул ³.

С Plug and Play системой VAHEAT также очень просто экспортировать данные о температуре из эксперимента. Поэтому компания Interherence надеется, что это устройство не только позволит проводить новые типы экспериментов, но и внесет свой вклад в улучшение отчетов об экспериментах и воспроизводимости экспериментов с визуализацией, что позволит каждому использовать высокочувствительную микроскопию.

Компания Interherence

Interherence GmbH образовалась сотрудниками Института Макса Планка в Эрлангене, Германия. С 2020 года компания занимается разработкой оборудования следующего поколения для высокочувствительной оптической микроскопии в биологических науках, материаловедении и фармацевтической промышленности. Уникальные продукты Interherence являются результатом сочетания оптики с современными методами микро- и нанопроизводства. Миниатюрная нагревательная система VAHEAT для микроскопа - первый продукт, выпущенный Interherence на рынок. Это эффективная технология для микроскопии многих чувствительных к температуре процессов, которые раньше невозможно было визуализировать. Следующий продукт будет запущен в 2022 году.