Латеральное разрешение ре-сканирующего конфокального оптического модуля RCM2, измеренное с помощью калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM

Вступление

Разрешение оптического микроскопа определяется как кратчайшее расстояние между двумя точечными источниками на исследуемом образце до тех пор, пока их можно различить как отдельные объекты. Определение разрешения оптического микроскопа точно и объективно может быть сложной задачей. Чаще всего используются шарики размером меньше оптического дифракционного предела для оценки разрешения микроскопа. Использование эти шариков затруднено тем, что иногда трудно сфокусироваться на них, и со временем они обесцвечиваются. Кроме того, поскольку их размер не бесконечно мал, они расширяют функцию рассеяния точки микроскопа (PSF), поэтому занижается разрешающая способность оптической системы.

Ре-сканирующий конфокальный микроскоп (RCM – re-scan confocal microscope) основан на принципе повторного сканирования, который увеличивает поперечное разрешение в 1.4 раза по сравнению со стандартными конфокальными системами. Оптический модуль RCM выходит за дифракционный предел, достигая латеральное разрешение 170 нм на длине волны 488 нм и 120 нм после программной обработки методом деконволюции.

В данной статье мы продемонстрировали разрешение полученное с помощью оптического модуля RCM2, подтвержденное узором «постепенно разнесенные линии» внутри калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM (рис. 1).

Рисунок 1. Изображение калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM.

Материалы и методы

Изображения предметного стекла Argo-SIM сделанные оптическим модулем RCM2 были получены с помощью микроскопа Olympus IX83 с масляным объективом 100x/1.5 (UPLAPO100XOHR). Для возбуждения флуоресцентных шаблонов излучением с длиной волны 405 нм использовался лазер Omicron Lighthub. Регистрация флуоресценции осуществлялась камерой Tucsen FL20-BW.

Настройки сбора данных привели к тому, что размер пикселя в плоскости образца составил 16,5 нм/пиксель. Шаговый двигатель микроскопа по оси Z был установлен на интервал 100 нм, получая в целом z-стек размером 4 мкм для последующей деконволюции. Впоследствии деконволюция была выполнена с помощью ПО Microvolution со специальной функцией распределения точки оптимизированной для оптического модуля RCM.

На рисунках показан срез z-стека с наилучшим фокусом. Последующий анализ наборов данных был выполнен с помощью программного обеспечения Daybook 3 от Argolight, используя модель подгонки Гаусса и критерий контрастности 7,3% (соответствует значению контраста равному FWHM PSF функции микроскопа в идеальных условиях визуализации).

Рис. 2. Изображения предметного стекла Argo-SIM сделанные оптическим модулем RCM2.

Изображение A - Необработанное изображение. 2 линии можно различить на глаз на расстоянии 150 нм. Изображение А’ - Увеличение области внутри красного квадрата. Изображение B - Развернутое изображение, где 2 линии могут быть различимы на расстоянии 120 нм. Изображение B’ - Увеличение площади внутри красного квадрата. Цифры указывают межстрочный интервал в нанометрах.

Рисунок 3. Графики, показывающие контраст в зависимости от измеренного межстрочного интервала.

Изображение A – График, полученный с необработанным изображением, демонстрирует разрешение 170 нм при уровне контрастности 7,3%. Изображение B - График, полученный с помощью обработанного деконволюцией изображения, показывает улучшение разрешения до 120 нм.

Полученные результаты

Калибровочное предметное стекло Argo-SIM  позволяет точно определить латеральное разрешение конфокального ре-сканирующего микроскопа RCM2. В этом эксперименте мы использовали предметное стекло Argo-SIM для оценки разрешения оптического модуля RCM2 с конфигурацией описанной в методике.

Полученные изображения показали шаблон предметного стекла Argo-SIM, состоящий из вертикально расположенных выровненных линий с шагом 30 нм на двух центральных линиях, начиная с 0 нм и заканчивая расстоянием 390 нм. Глядя на необработанные изображения невооруженным глазом, мы смогли различить интервал 150 нм (рис. 2А).

Анализ изображений проводился с использованием подходящей Гауссовой модели и критерием контрастности 7,3%, что соответствует PSF функции микроскопа в идеальных условиях визуализации. В необработанном изображении критерий контрастности 7,3% был достигнут при интервале между линиями 178,5 нм (рис. 3A, таблица 1). Эти результаты точно соответствовали спецификации ранее присвоенной оптическому модулю RCM2.

На этих изображениях была выполнена деконволюция, что привело к значительному увеличению разрешения. Деконволюция изображения позволили нам различить образец размером 120 нм невооруженным взглядом (рис. 2B), что было подтверждено результатами анализа изображения (131,8 нм при уровне контраста 7,3%) (рис. 3B, таблица 1).

Таблица 1. Основные показатели при измерении разрешения.

Выводы

Калибровочное предметное стекло Argo-SIM позволило нам количественно и точно определить значение латерального разрешения оптического модуля RCM2 без предвзятости пользователя. В необработанных конфокальных изображениях оптический модуль RCM2 смог достичь разрешения 178.5 нм при уровне контраста 7.3%. После деконволюции при уровне контраста 7.3% разрешение было дополнительно улучшено до 131.8 нм. Согласно основным показателям сообщаемым программой Daybook Argolight разрешение изображений при нулевом контрасте составляет 144,6 и 104,9 нм для необработанных и деконволюционных данных соответственно. Эти результаты демонстрируют, что оптический модуль RCM2 для ре-сканирующей конфокальной микроскопии обеспечивает получение изображений со сверхвысоким разрешением.