Латеральное разрешение ре-сканирующего конфокального оптического модуля RCM2, измеренное с помощью калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM

Вступление

Разрешение оптического микроскопа определяется как кратчайшее расстояние между двумя точечными источниками на исследуемом образце до тех пор, пока их можно различить как отдельные объекты [1]. Определение разрешения оптического микроскопа точно и объективно может быть сложной задачей. Чаще всего используются шарики размером меньше оптического дифракционного предела для оценки разрешения микроскопа. Использование эти шариков затруднено тем, что иногда трудно сфокусироваться на них, и со временем они обесцвечиваются. Кроме того, поскольку их размер не бесконечно мал, они расширяют функцию рассеяния точки микроскопа (PSF), поэтому занижается разрешающая способность оптической системы.

Ре-сканирующий конфокальный микроскоп (RCM – re-scan confocal microscope) основан на принципе повторного сканирования [2], который увеличивает поперечное разрешение в 1.4 раза по сравнению со стандартными конфокальными системами. Оптический модуль RCM выходит за дифракционный предел, достигая латеральное разрешение 170 нм на длине волны 488 нм и 120 нм после программной обработки методом деконволюции.

В данной статье мы продемонстрировали разрешение полученное с помощью оптического модуля RCM2, подтвержденное узором «постепенно разнесенные линии» внутри калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM [3] (рис. 1).

Рисунок 1. Изображение калибровочного предметного стекла Argolight Argo-SIM.

Материалы и методы

Изображения предметного стекла Argo-SIM сделанные оптическим модулем RCM2 были получены с помощью микроскопа Olympus IX83 с масляным объективом 100x/1.5 (UPLAPO100XOHR). Для возбуждения флуоресцентных шаблонов излучением с длиной волны 405 нм использовался лазер Omicron Lighthub. Регистрация флуоресценции осуществлялась камерой Tucsen FL20-BW.

Настройки сбора данных привели к тому, что размер пикселя в плоскости образца составил 16,5 нм/пиксель. Шаговый двигатель микроскопа по оси Z был установлен на интервал 100 нм, получая в целом z-стек размером 4 мкм для последующей деконволюции. Впоследствии деконволюция была выполнена с помощью ПО Microvolution со специальной функцией распределения точки оптимизированной для оптического модуля RCM.

На рисунках показан срез z-стека с наилучшим фокусом. Последующий анализ наборов данных был выполнен с помощью программного обеспечения Daybook 3 от Argolight, используя модель подгонки Гаусса и критерий контрастности 7,3% (соответствует значению контраста равному FWHM PSF функции микроскопа в идеальных условиях визуализации).

Рис. 2. Изображения предметного стекла Argo-SIM сделанные оптическим модулем RCM2.

Изображение A - Необработанное изображение. 2 линии можно различить на глаз на расстоянии 150 нм. Изображение А’ - Увеличение области внутри красного квадрата. Изображение B - Развернутое изображение, где 2 линии могут быть различимы на расстоянии 120 нм. Изображение B’ - Увеличение площади внутри красного квадрата. Цифры указывают межстрочный интервал в нанометрах.

Рисунок 3. Графики, показывающие контраст в зависимости от измеренного межстрочного интервала.

Изображение A – График, полученный с необработанным изображением, демонстрирует разрешение 170 нм при уровне контрастности 7,3%. Изображение B - График, полученный с помощью обработанного деконволюцией изображения, показывает улучшение разрешения до 120 нм.

Полученные результаты

Калибровочное предметное стекло Argo-SIM  позволяет точно определить латеральное разрешение конфокального ре-сканирующего микроскопа RCM2. В этом эксперименте мы использовали предметное стекло Argo-SIM для оценки разрешения оптического модуля RCM2 с конфигурацией описанной в методике.

Полученные изображения показали шаблон предметного стекла Argo-SIM, состоящий из вертикально расположенных выровненных линий с шагом 30 нм на двух центральных линиях, начиная с 0 нм и заканчивая расстоянием 390 нм. Глядя на необработанные изображения невооруженным глазом, мы смогли различить интервал 150 нм (рис. 2А).

Анализ изображений проводился с использованием подходящей Гауссовой модели и критерием контрастности 7,3%, что соответствует PSF функции микроскопа в идеальных условиях визуализации. В необработанном изображении критерий контрастности 7,3% был достигнут при интервале между линиями 178,5 нм (рис. 3A, таблица 1). Эти результаты точно соответствовали спецификации ранее присвоенной оптическому модулю RCM2.

На этих изображениях была выполнена деконволюция, что привело к значительному увеличению разрешения. Деконволюция изображения позволили нам различить образец размером 120 нм невооруженным взглядом (рис. 2B), что было подтверждено результатами анализа изображения (131,8 нм при уровне контраста 7,3%) (рис. 3B, таблица 1).

Таблица 1. Основные показатели при измерении разрешения.

Выводы

Калибровочное предметное стекло Argo-SIM позволило нам количественно и точно определить значение латерального разрешения оптического модуля RCM2 без предвзятости пользователя. В необработанных конфокальных изображениях оптический модуль RCM2 смог достичь разрешения 178.5 нм при уровне контраста 7.3%. После деконволюции при уровне контраста 7.3% разрешение было дополнительно улучшено до 131.8 нм. Согласно основным показателям сообщаемым программой Daybook Argolight разрешение изображений при нулевом контрасте составляет 144,6 и 104,9 нм для необработанных и деконволюционных данных соответственно. Эти результаты демонстрируют, что оптический модуль RCM2 для ре-сканирующей конфокальной микроскопии обеспечивает получение изображений со сверхвысоким разрешением.

Ссылки

[1] https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/resolution

[2] Giulia MR de Luca, Ronald MP Breedijk, Rick AJ Brandt, Christiaan HC Zeelenberg, Babette E de Jong, Wendy Timmermans, Leila Nahidi Azar, Ron A Hoebe, Sjoerd Stallinga, and Erik MM Manders. “Re-scan confocal microscopy: scanning twice for better resolution”. Biomed Opt Express. 2013. DOI 10.1364/BOE.4.002644

[3] https://argolight.com/products/argo-sim/