Арт. MIRAVA POLYSCOPE
Современную высококлассную флуоресцентную микроскопию невозможно представить без лазеров, которые позволяют вызывать флуоресценцию точно там и именно так, как это необходимо. Более чем достаточный повод рассмотреть эти сложные источники света подробнее.
Начнём с, казалось бы, очевидного факта: оптическая микроскопия требует света. Образец должен быть каким-то образом освещён, чтобы можно было получить информацию о его форме и структуре. В классической широкопольной микроскопии требования к свету довольно просты: он должен быть достаточно ярким, чтобы обеспечить нужную детализацию. Стандартные широкопольные микроскопы обычно используют ртутные или ксеноновые газоразрядные лампы либо светодиоды, при этом свет равномерно распределяется по всему образцу.
В конфокальной флуоресцентной микроскопии ситуация гораздо сложнее, а в микроскопии со стимулированным испусканием (STED) — тем более. Именно поэтому в компании abberior теме лазеров уделяется особое внимание.
Но прежде чем углубляться в детали, давайте разберёмся, какие требования конфокальная микроскопия предъявляет к источнику света. Во-первых, в каждый момент времени исследуется лишь очень небольшой участок образца, и свет должен быть сфокусирован точно в этой точке. Во-вторых, флуоресцентная микроскопия основана на использовании флуоресцентных молекул — флуорофоров — в исследуемом образце. При облучении светом определённой длины волны эти молекулы излучают свет другой (как правило, большей) длины волны.
(Длина волны определяет цвет света: например, свет с длиной волны около 450 нм — синий, около 700 нм — красный, а зелёный и жёлтый находятся между ними.) Каждый флуорофор имеет собственный спектр возбуждения — диапазон, в котором он поглощает энергию света, — и спектр эмиссии — диапазон, в котором он излучает свет. Для эффективной работы возбуждающий свет должен иметь строго определённую длину волны и быть хорошо фокусируемым. Именно поэтому здесь необходим лазер.
Все знают, что такое лазер… верно?
Слово laser — это аббревиатура от Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation («усиление света за счёт вынужденного излучения»), что описывает принцип генерации лазерного излучения. Даже дети — и не только те, кто смотрел «Звёздные войны» — знают, что лазеры создают мощные световые лучи самых разных цветов.
И это описание на самом деле довольно близко к строгому физическому определению, согласно которому лазер — это источник света, генерирующий монохроматическое, когерентное и направленное излучение.
Что это значит?
По порядку. Лазерный свет:
- монохроматичен — состоит из одной длины волны или очень узкого диапазона длин волн, соответствующих определённому цвету;
- когерентен — имеет единую форму волны и частоту;
- направлен — все световые волны распространяются в одном направлении, образуя пучок.
Ни одно из этих свойств не характерно для классических источников света. Именно поэтому появление лазеров в 1960-х годах вызвало лавинообразное развитие новых технологий, использующих уникальные возможности лазерного излучения.
Таблица 1. Сравнение классических источников света и лазеров. Лазеры генерируют монохроматическое, когерентное и направленное излучение
При этом не существует «одного-единственного» лазера. Со временем было разработано множество типов лазеров с весьма различными свойствами, оптимально подходящими для самых разных применений — от лазерных указок до принтеров, сканеров, сварочных установок, медицинских и научных приборов. Обычно лазеры классифицируют по активной среде, которая является источником излучения: различают газовые, жидкостные, твердотельные и полупроводниковые (диодные) лазеры.
Энергия для возбуждения
В микроскопии лазеры чаще всего используются для возбуждения флуорофоров. Типичный лазер возбуждения имеет выходную мощность в диапазоне нескольких милливатт. Долгое время одним из наиболее распространённых лазеров во флуоресцентной микроскопии был аргон-ионный лазер. Он излучает сразу несколько длин волн, которые хорошо совпадают со спектрами поглощения различных флуоресцентных красителей. Это позволяет одновременно возбуждать несколько красителей и выполнять многоканальную съёмку.
Другой популярный тип лазеров — гелий-неоновые (HeNe). Они излучают свет с одной фиксированной длиной волны (обычно в красной области спектра), что делает их стабильными и простыми в использовании.
В последние годы компактные и доступные диодные лазеры вытеснили многие другие типы. Они обладают рядом преимуществ, включая низкое энергопотребление, высокую эффективность и простоту эксплуатации. Кроме того, такие лазеры могут работать в импульсном режиме, что особенно важно для флуоресцентной микроскопии.
Импульсный режим означает, что лазерное излучение испускается не непрерывно (как в случае непрерывных, или cw-лазеров), а в виде коротких периодических импульсов длительностью обычно несколько сотен пикосекунд с паузами порядка десятков наносекунд. В результате энергия концентрируется в коротких импульсах, что существенно снижает энергетическую нагрузку на образец. Это критически важно для исследований живых клеток, так как уменьшаются фотообесцвечивание и фототоксичность. Кроме того, импульсные лазеры являются необходимым условием для флуоресцентной микроскопии времени жизни (FLIM), основанной на измерении времени между световым импульсом и регистрацией фотонов.
Микроскопы STEDYCON, MIRAVA POLYSCOPE и INFINITY компании abberior оснащаются диодными лазерами возбуждения с мощностью менее 100 мкВт.
Белые лазеры — решение всех проблем?
В последнее время всё большее распространение получают волоконные импульсные лазеры белого света. Их главное преимущество — универсальность: они излучают не на одной или нескольких длинах волн, а практически по всему спектру. Но постойте — вы заметили противоречие? Белые лазеры, на первый взгляд, нарушают определение лазера, так как их излучение не является монохроматическим.
На самом деле белый свет в них генерируется с помощью нелинейного оптического процесса из монохроматического излучения. При этом свет остаётся направленным и когерентным, что соответствует определению лазера. Поэтому такие источники вполне корректно называть белыми лазерами.
С помощью перестраиваемого фильтра из спектра белого лазера можно выбрать любую нужную длину волны. Звучит отлично, не так ли? Однако у этого подхода есть существенные недостатки: высокая стоимость и сложность как самого лазера, так и необходимых перестраиваемых фильтров. Кроме того, при выходе из строя единственного лазера весь микроскоп становится непригодным к работе.
В сверхразрешающей микроскопии у белых лазеров есть ещё один принципиальный минус. Поскольку широкий диапазон длин волн исходит из одного источника, невозможно полностью компенсировать хроматические аберрации для всех длин волн и всех объективов, что заметно снижает качество изображения.
Энергия для подавления флуоресценции
Микроскопия со стимулированным испусканием (STED) выводит требования к лазерам на новый уровень сложности, так как здесь флуорофоры не только возбуждаются, но и целенаправленно «гасится» их флуоресценция. Свет для подавления нежелательного свечения подаётся STED-лазером, и требования к нему существенно отличаются от требований к лазеру возбуждения.
Прежде всего, STED-лазеры должны обеспечивать значительно более высокую интенсивность излучения и работать в импульсном режиме. Высокая интенсивность необходима для эффективного подавления флуоресценции в области действия STED-пучка, а импульсный режим — для точной концентрации энергии во времени, непосредственно после импульса возбуждения, когда воздействие на возбужденный краситель максимально эффективно.
Фотоны, попадающие на образец вне этого узкого временного окна, совершенно бесполезны и лишь вызывают фотообесцвечивание флуорофоров или повреждение образца. Именно поэтому непрерывные (CW) STED-лазеры не являются практичным решением.
Сравнение непрерывного STED и импульсного STED от abberior. В CW-STED лазер постоянно освещает образец, при этом значительная часть энергии расходуется вне временного интервала флуоресценции, вызывая избыточное фотообецвечивание. Импульсный STED-лазер abberior концентрирует энергию во времени сразу после импульса возбуждения, обеспечивая максимальный эффект на возбужденные флуорофоры.
Ранее в STED-микроскопах часто использовались импульсные титан-сапфировые лазеры, однако компактные, надёжные и доступные волоконные лазеры во многом сделали их устаревшими для этой задачи. STED-лазеры, устанавливаемые в микроскопах abberior, представляют собой импульсные диодные лазеры мощностью от 1 до 3 Вт.
Каждая сверхразрешающая методика предъявляет свои требования
Сверхразрешающие методы, такие как PALM и STORM — основные разновидности микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM), — предъявляют иные требования к лазерам. Поскольку это по сути широкопольные методы, возбуждающий свет постоянно распределён по всему полю зрения. Для достижения необходимой локальной плотности мощности требуется использование высокомощных, как правило волоконных, лазеров с выходной мощностью от 1 до 5 Вт.
MINFLUX — это метод флуоресцентной микроскопии одиночных молекул, позволяющий достичь молекулярного разрешения и рекордного временного разрешения. Можно было бы ожидать, что такая передовая технология требует особенно сложных лазеров. Требования действительно отличаются от STED, но не обязательно являются более жёсткими. Обычно в установках MINFLUX используются диодные лазеры мощностью несколько сотен милливатт.
