Лучшие флуорофоры для визуализации методом PALM микроскопии

Фотоактивированная локализационная микроскопия, или PALM микроскопия, представляет собой метод сверхвысокого разрешения, который основан на случайной активации флуорофоров для пространственного разрешения молекулярных деталей. Вкратце, при активации с помощью соответствующего лазера редкое количество флуорофоров выделяется за короткий период до их фотообесцвечивания. Поскольку флуорофоры активируются одновременно только в небольшом количестве, пока все не испустятся, можно локализовать и отслеживать отдельные молекулы с течением времени.

Подобно любым методам локализованной микроскопии с одной молекулой (SMLM), ключом к успеху в визуализации PALM микроскопии является использование правильных флуорофоров. Микроскопия PALM особенно рекомендуется для визуализации живых клеток, подсчета и отслеживания молекул в клетках или в растворе, так как большинство флуорофоров обычно активируются только один раз - за исключением тех, которые обладают фотопереключаемыми свойствами. Напротив, микроскопия dSTORM, где применяются фототоксичные буферы и мощные лазеры, чтобы побудить флуоресцентные красители проходить через несколько состояний включения и выключения перед фотообесцвечиванием, в основном подходит для фиксированных образцов. В этой статье мы кратко рассмотрим некоторые из различных фотоактивируемых, фотоконвертируемых или фотопереключаемых флуорофоров, которые можно использовать для визуализации PALM в живых клетках, учитывая Ваши экспериментальные требования и локализацию белка в клетке.

Фотоактивируемые флуорофоры

Фотоактивируемые флуорофоры (PA – Photoactivatable fluorophores) излучают свет при активации, чаще всего с помощью ультрафиолетового излучения, и являются наиболее часто используемыми флуорофорами при визуализации PALM. Они являются фотоактивируемыми версиями обычно используемых флуоресцентных белков (FP), которые могут быть смешаны с интересующим белком. Важно иметь в виду, что фотоактивируемые флуорофоры темны по своей природе, и поначалу изображение может быть сложным (клетки тоже будут темными!), что требует некоторой оптимизации.

PA-GFP: возбуждение флуорофора 504 нм, эмиссия 517 нм (зеленый), фотоактивация ультрафиолетовым излучением (405 нм) для излучения с высокой эмиссией или синим (488 нм) лазером для излучения с низкой эмиссией. Рекомендуется для некоторых экспериментов с живыми клетками и многоцветными экспериментами. Предлагает меньшую гибкость и сложность в экспериментальном дизайне, чем другие. Этот флуорофор может димеризоваться, некоторые точечные мутанты были разработаны, чтобы предотвратить это.

PA-TagRFP: возбуждение флуорофора 562 нм, эмиссия 595 нм (красный), фотоактивация ультрафиолетовым излучением (405 нм). Очень яркий, фотостабильный флуорофор мономерной природы, превосходная белковая метка как для обычной микроскопии, так и для микроскопии PALM со сверхвысоким разрешением. Хорошо подходит для двухцветной визуализации PALM микроскопии.

PA-mCherry1: возбуждение флуорофора 570 нм, эмиссия 596 нм (красный), фотоактивация ультрафиолетовым излучением (405 нм). Быстро созревающий мономер с высокой чувствительностью к pH кислотности. Хорошо подходит для двухцветной визуализации PALM микроскопии. Тем не менее, его низкое количество фотонов делает его одним из худших флуорофоров для отслеживания PALM.

PA-mKate2: возбуждение флуорофора 586 нм, эмиссия 628 нм (ярко-красный), различные механизмы фотоактивации, могут быть фотоактивированы ультрафиолетовым излучением (405 нм). Мономерный темно-красный, более высокая стабильность pH кислотности и более медленное фотообесцвечивание, чем у PA-mCherry1.

Фотоконвертируемые флуорофоры

Фотоконвертируемые флуорофоры (PC - Photoconvertible fluorophores) это флуоресцентные белки, которые уже излучают флуоресценцию в своем неконвертированном состоянии и изменяют спектр излучения при активации, чаще всего с ультрафиолетовым излучением. Конверсия необратима. Они обеспечивают точную локализацию благодаря высокому выходу фотонов. Некоторые из широко используемых фотоконвертируемых флуорофоров, большинство от зеленого до красного, являются:

PS-CFP2: необратимое фотопереключение с голубого на зеленый, возбуждение флуорофора 400 нм (голубой) и 490 нм (зеленый), эмиссия 468 нм (голубой) и 511 нм (зеленый), фотопреобразование ультрафиолетовым излучением (405 нм). Легко визуализируется без фотоактивации, высокая стабильность pH кислотности и является хорошим кандидатом для многоцветной визуализации.

Kaede: возбуждение 508 нм (зеленый) и 572 нм (красный), эмиссия 518 нм (зеленый) и 582 нм (красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Первый фотоконвертируемый флуорофор. Его тетрамерная природа делает его сложным для использования в экспериментах по визуализации живых клеток, поскольку олигомеризация может вызывать артефакты и неправильное толкование изображения.

MEOS2: возбуждение 506 нм (зеленый) и 573 нм (красный), эмиссия 519 нм (зеленый) и 584 нм (красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Лучше, чем его более ранняя версия tdEOS (которая тетрамеризуется), но имеет тенденцию образовывать димеры и олигомеры высокого порядка в высоких концентрациях, что делает его непригодным для маркировки мембранных белков. Вместо этого рекомендуется использовать более позднюю версию mEos3.2 или mMaple3.

mEos3.2: возбуждение 507 нм (зеленый) и 572 нм (красный), эмиссия 516 нм (зеленый) и 580 нм (красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Флуорофор mEos3.2 является действительно мономерным, более ярким, созревает быстрее и демонстрирует более высокий баланс фотонов и плотность меток. Наряду с флуорофором mMaple3 считается лучшим среди фотоконвертируемых флуорофоров от зеленого до красного.

mEos4b: возбуждение 505 нм (зеленый) и 569 нм (красный), эмиссия 516 нм (зеленый) и 581 нм (красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Устойчив к тетроксиду осмия, разработан для корреляционной визуализации электронно-лучевой микроскопии.

mMaple3: возбуждение 489 нм (зеленый) и 566 нм (красный), эмиссия 505 нм (зеленый) и 583 нм (красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Совсем недавно был введен фотоконвертируемый флуорофор для локализации одной молекулы, очень высокий уровень детектируемости флуорофора по сравнению с общим соотношением флуорофоров.

Dendra2: возбуждение 490 нм (зеленый) и 553 нм (красный), эмиссия 507 нм (зеленый) и 573 нм (красный), фотоактивация с помощью ультрафиолетового излучения (405 нм) или синего (488 нм) лазера. Активация синим светом и хорошая производительность делают Dendra2 хорошим кандидатом для микроскопии локализации одиночных молекул живых клеток. Недавние усилия были направлены на улучшение этого флуорофора путем использования первичного фотопреобразования в сочетании с УФ-фотоактивацией, так что флуоресцентные белки могут быть специально фотоконвертированы с помощью различных длин волн света с использованием режимов фотоконвертации и УФ-активации, но излучают флуоресценцию в том же спектральном канале излучения. Другой подход доказал снижение фототоксичности при визуализации одиночных молекул живыми клетками путем введения точечных мутаций для облегчения фотопреобразования Dendra2 с использованием синего и дополнительного ближнего инфракрасного света.

PSmOrange: возбуждение 561 нм (оранжевый) и 636 нм (дальний красный), эмиссия 565 нм (оранжевый) и 662 нм (дальний красный), фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм) или синим (488 нм) лазером. Фотопереключение PSmOrange происходит посредством двухэтапного процесса фотоокисления, который вызывает расщепление основной цепи полипептида. Сдвинутые в красный цвет спектры обеих форм PSmOrange позволяют одновременно использовать его с фотопереключаемыми белками голубого цвета в зеленый, что делает его пригодным для многоцветной микроскопии с высоким разрешением для изучения различных маркеров.

Фотопереключаемые флуорофоры

В отличие от фотоактивируемых флуорофоров, фотопереключаемые флуорофоры (PS - Photoswitchable fluorophores) являются обратимыми и способны переключаться между нефлуоресцентным и флуоресцентным состоянием, циклы которого могут повторяться несколько сотен раз без фотообесцвечивания. Они имеют тенденцию быть яркими и, следовательно, дают высокую точность локализации. Однако, если Вы хотите изучать динамику белков с индивидуальной маркировкой с течением времени при визуализации в реальном времени PALM, будет лучше использовать фотоактивируемые или фотоконвертируемые флуоресцентные белки, которые будут излучаться только один раз.

Dronpa: возбуждение 503 нм, эмиссия 518 нм (зеленый), фотоактивация с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Реверсивно переключаемый с темного на зеленый. Мы рекомендуем использовать флуорофор PS-CFP2 вместо этого флуорофора для большинства приложений локализации одной молекулы. Обширный мутагенез Dronpa был использован для генерации дополнительных вариантов флуорофоров с более быстрой кинетикой фотопереключения, таких как rsFastlime и Padron, которые демонстрируют поведение переключения, относящееся к поведению всех зеленых флуоресцентных обратимо переключаемых флуоресцентных белков, известных на сегодняшний день.

mGeosM: возбуждение 503 нм, эмиссия 514 нм (зеленый), фотоактивация с ультрафиолетовым излучением (405 нм). Лучше, чем Dronpa, но с более высоким рабочим циклом, чем PS-CFP2. Флуорофор mGeos был создан путем мутации первых аминокислот в хромофоре фотоконвертируемого флуоресцентного белка mEos2.

Dreiklang: возбуждение 515 нм, эмиссия 529 нм (зеленый), фото-деактивация ультрафиолетовым излучением (405 нм). Обратимое включение-выключение в живых клетках осуществляется на двух разных длинах волн 365 нм и 405 нм соответственно, тогда как флуоресценция выявляется при 515 нм. Флуорофор имеет высокую кислотную чувствительность, низкую контрастность при низких значениях pH, поэтому он не будет работать во всех клеточных ячейках.

MIRISGFP: возбуждение 486 нм (зеленый) и 516 нм (красный), эмиссия 546 нм (зеленый) и 578 нм (красный). Фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм) от темного до зеленого и от зеленого до красного; или фотопреобразование с синим (488 нм) от темного до красного. Фотопреобразование из зеленого в красное состояние, как в зеленом, так и в красном состояниях обратимо переключается в темное состояние.

NijiGFP: возбуждение 469 нм (зеленый) и 526 нм (красный), эмиссия 507 нм (зеленый) и 569 нм (красный). Фотопреобразование с ультрафиолетовым излучением (405 нм) от темного до зеленого и от зеленого до красного; или фотопреобразование с синим (488 нм) от темного до красного. Фотопреобразование из зеленого в красное состояние, как в зеленом, так и в красном состояниях обратимо фотопереключается в темное состояние.

Изображение: PALM-визуализация контроля бактерий Escherichia coli (слева) или лечения антибиотиком (справа), в котором количество молекул слитых белков транскрипционного фактора-Dendra2 определяли количественно для каждого состояния. Образец предоставлен лабораторией профессора Михаэля Шлирфа в B CUBE - Центре молекулярной биоинженерии TU Dresden.

Альтернативные методы маркировки: теги Halo

Альтернативный подход к маркировке красителями, который получил признание в последние годы - это использование гибридных систем; комбинация генетически кодируемых белковых меток с отдельным проницаемым для клеток синтетическим флуоресцентным лигандом. К ним относятся белки, помеченные меткой SNAP, меткой CLIP и наиболее часто используемым HaloTag® - системой, которая использует ряд флуоресцентных лигандов, таких как тетраметилродамин (TMR) и Janelia Fluor® 549 или 646. Эти метки сочетают в себе преимущества генетически кодируемых флуоресцентных белков с превосходной яркостью синтетических красителей и фотостабильностью (менее подвержены фотообесцвечиванию, чем флуорофоры), но требуют трудоемкого процесса маркировки. В случае оптимизации эти системы позволяют исследователям проводить высокоскоростное и одноцветное отслеживание одной молекулы в живых клетках.

Не только генетически кодируемые флуоресцентные белки могут быть использованы для визуализации PALM микроскопии. Также могут быть использованы синтетические красители или квантовые точки, конъюгированные с антителами. Однако они подходят только для фиксированных образцов, не подходят для визуализации живых клеток, и специфическое таргетирование интересующего белка может быть более сложной задачей. Для их использования клетки должны быть проницаемыми для обеспечения доступа через плазматическую мембрану и внутрь клетки, а уровни интенсивности флуоресценции могут варьироваться в зависимости от концентрации меченого вторичного антитела или флуоресцентного красителя.

Изображение: Отслеживание одной частицы T3SS-HALO, окрашенного JF549 в живых бактериях. Образец предоставлен доктором А. Дипольдом, Институт наземной микробиологии им. Макса Планка, Марбург, Германия. Масштабная шкала составляет 1 мкм.