Арт. STEDYCON 2
С момента открытия дифракционного предела световой микроскопии в конце XIX века [Abbe, E. 1873] было принято, что обычная оптическая микроскопия в дальнем поле не позволяет разрешать структурные детали размером менее половины длины волны света. Методы флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, такие как STED-микроскопия [Hell, S. W., 1994; Sahl, S. J. , S. W. Hell, S. Jakobs 2017], преодолевают это ограничение. В данной работе представлены надёжные протоколы подготовки образцов для STED-микроскопии клеток млекопитающих. Эти протоколы могут использоваться как отправная точка для адаптации существующих стратегий мечения к требованиям STED-микроскопии.
Материалы для иммунофлуоресцентного и фаллоидинового мечения клеток млекопитающих
Пинцеты
Для работы с покровными стёклами рекомендуется использовать пинцеты с очень тонкими кончиками, например, Dumont № 5 (прямые) или Dumont № 7 (изогнутые).
Метанол, абсолютированный (ТОКСИЧЕН!)
Для фиксации абсолютный метанол необходимо охладить до −20 °C.
Раствор формальдегида (ТОКСИЧЕН!)
Для фиксации используется свежеприготовленный раствор формальдегида, забуференный до нейтрального pH. Раствор готовят из параформальдегида. После приготовления его не следует использовать более 1–2 недель (при хранении при +4 °C). В качестве альтернативы раствор формальдегида можно сразу после приготовления заморозить при −20 °C или −80 °C, что позволяет хранить и использовать его более длительное время. Концентрацию формальдегида и время фиксации необходимо подбирать индивидуально для каждого антигена/первичного антитела. Типичные концентрации — 2–8 %.
Экстрагирующий раствор
В качестве экстрагирующего раствора применяются буферные растворы детергентов, таких как Tween 20, Triton X-100, сапонин или SDS. Для многих применений используется раствор: PBS + 0,1–0,5 % Triton X-100.
«Влажная камера»
Готовые влажные камеры доступны у различных поставщиков. В качестве альтернативы можно использовать большие стеклянные чашки Петри, снабжённые держателем для покровных стёкол (например, держатель наконечников от коробки для пипеточных наконечников).
Фосфатно-солевой буфер (PBS, pH 7,0–7,5)
|
Компонент |
Концентрация |
|
NaCl |
137 мМ |
|
KCl |
2,7 мМ |
|
Na₂HPO₄ |
10 мМ |
|
KH₂PO₄ |
2 мМ |
Блокирующий раствор
Для специфического иммуномечения внутриклеточных структур необходимо предотвращать неспецифическое связывание. Для этого применяются растворы, содержащие белки, не мешающие реакции фаллоидина или антител, например, бычий сывороточный альбумин, желатин, экстракт дрожжей или молоко (из сухого молока).
Для многих применений используется раствор: PBS + 0,1 % Tween 20 + 1–5 % бычьего сывороточного альбумина (BSA). Далее этот блокирующий раствор PBS/BSA/Tween 20 обозначается как PBT.
Первичные антитела
Для STED-микроскопии доступен широкий спектр первичных антител. Примеры приведены в таблице 1.
Вторичные антитела
Для STED-микроскопии могут использоваться вторичные антитела, конъюгированные с красителями abberior. Примеры приведены в таблице 2. Стандартное разведение вторичных антител abberior — 1:200.
Флуорофорно-меченый фаллоидин (ТОКСИЧЕН!)
Обычно фаллоидин поставляется в лиофилизированном (твёрдом) виде. После получения его необходимо растворить в абсолютном метаноле, безводном DMF или безводном DMSO (см. Примечание 1). В зависимости от применения, клеточной линии и других факторов фаллоидин используют в концентрации 1–2 ед./мл в водном буфере.
Среды для заливки / монтирования
Существует широкий выбор сред для заливки. Для 3D-STED-микроскопии рекомендуется использовать неотверждаемые среды, такие как abberior Mount Liquid Antifade. Для 2D-STED-микроскопии рекомендуются: abberior Mount Solid Antifade, Mowiol/DABCO, ProLong Gold, ProLong Diamond (см. Примечание 2).
Покровные стёкла
При использовании масляных объективов 60× и 100× следует применять стеклянные покровные стёкла толщиной около 170 мкм (№ 1.5 или № 1.5H). Не используйте пластиковые покровные стёкла или камеры для живых клеток с пластиковым дном. Также не следует использовать покровные стёкла с сетками, решётками или аналогичными структурами, так как они могут вызывать аберрации и искажения изображения.
Предметные стёкла
Единственное требование — соответствие держателю образцов микроскопа. Использование SuperFrost-стёкол не является обязательным.
Пластиковые или стеклянные чашки Петри
Используются для фиксации, блокирования и промывки образцов.
Пипетки
Стандартные микропипетки с регулируемым объёмом.
Протоколы мечения
Протокол I
Иммунофлуоресцентное мечение культивируемых адгезивных клеток млекопитающих — фиксация метанолом
1. Культивирование клеток
Клетки обычно высеивают на покровные стёкла за 12–36 ч до мечения (Примечания 3, 4).
Таблица 1. Коммерческие первичные антитела для создания тестовых образцов
|
Мишень |
Источник |
Специфичность |
Фиксация |
|
Ядерный поровый комплекс |
мышь (моноклональные) |
Nup153 (Abcam, ab24700) |
Метанол или 2–8 % формальдегид |
|
γ-тубулин |
мышь (моноклональные) |
α-тубулин (Sigma, T6074) |
Метанол |
Таблица 2. Красители abberior, часто используемые для STED-визуализации
|
Краситель |
Линия возбуждения |
Детектирование |
STED |
|
abberior STAR GREEN |
488 нм |
500–550 нм |
595 нм |
|
abberior STAR ORANGE |
561 нм |
570–630 нм |
775 нм |
|
abberior STAR RED |
640 нм |
650–750 нм |
775 нм |
2. Фиксация и блокирование
Образцы фиксируют в течение 5 мин охлаждённым до −20 °C абсолютным метанолом, располагая клетки вверх (Примечания 5–10). Затем покровные стёкла промывают PBS (Примечания 11–13). Неспецифические сайты связывания блокируют раствором PBT не менее 15 мин при комнатной температуре (RT) (Примечание 14).
3. Инкубация с первичными антителами
Покровные стёкла переносят во влажную камеру и инкубируют с 25–100 мкл разведённого в PBT раствора антител в течение 1 ч при RT (Примечание 15).
Конфокальное и STED-изображение клеток млекопитающих, фиксированных метанолом и меченных антителами к тубулину и вторичными антителами с abberior STAR RED.
4. Промывание
Покровные стёкла извлекают из влажной камеры. Раствор антител удаляют, аккуратно отбирая жидкость пипеткой, после чего край покровного стекла прикасают к фильтровальной бумаге (салфетке) для удаления остаточной жидкости. Затем покровные стёкла переносят в чистую чашку Петри с PBS (примечания 13, 16) и инкубируют более 5 минут при комнатной температуре (2 раза). При необходимости после этого этапа возможно дополнительное блокирование раствором PBT (опционально).
5. Инкубация со вторичными антителами
Покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBS удаляют, прикасаясь краем стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла помещают во влажную камеру и покрывают 25–100 мкл (в зависимости от диаметра покровного стекла) разведённого раствора вторичных антител в PBT (примечание 15). Инкубацию проводят в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Промывание
Покровные стёкла извлекают из влажной камеры. Раствор антител удаляют пипеткой, после чего край покровного стекла прикасают к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла переносят в чистую чашку Петри с PBS (примечания 13, 16, 17) и инкубируют не менее 5 минут при комнатной температуре (3 раза).
7. Монтирование, хранение, стабильность
В завершение покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBS удаляют, прикасаясь краем стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла монтируют с использованием выбранной среды для заливки (монтирования).
Конфокальное и STED-изображение клеток, фиксированных формальдегидом и меченных антителами к Nup153 и abberior STAR RED.
Протокол II
Иммунофлуоресцентное мечение культивируемых адгезивных клеток млекопитающих — фиксация формальдегидом
1. Культивирование клеток
Клетки, как правило, высеивают на покровные стёкла за 12–36 часов до проведения мечения (примечания 3, 4).
2. Фиксация, экстракция и блокирование
Покровные стёкла фиксируют раствором формальдегида, располагая клетки вверх (примечания 5, 6, 7, 8, 9, 10), в течение 5 минут. Затем проводят экстракцию клеток с использованием 0,1–0,5 % Triton X-100 в PBS (примечание 11) также в течение 5 минут. После этого покровные стёкла промывают PBS (примечания 12, 13). В завершение неспецифические сайты связывания блокируют раствором PBT не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) в чашке Петри (примечание 14).
3. Инкубация с первичными антителами
Покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBT удаляют, прикасаясь краем покровного стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла помещают во влажную камеру, наносят 25–100 мкл (в зависимости от диаметра покровного стекла) разведённого раствора первичных антител в PBT (примечание 15) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Промывание
Покровные стёкла извлекают из влажной камеры. Раствор антител удаляют пипеткой, после чего край покровного стекла прикасают к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла переносят в чистую чашку Петри с PBS (примечания 13, 16) и инкубируют не менее 5 минут при комнатной температуре (2 раза). После данного этапа при необходимости возможно дополнительное блокирование раствором PBT (опционально).
Конфокальное изображение культивируемых клеток млекопитающих, фиксированных формальдегидом и меченных фаллоидином, конъюгированным с abberior STAR RED.
5. Инкубация со вторичными антителами
Покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBS удаляют, прикасаясь краем покровного стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла помещают во влажную камеру, наносят 25–100 мкл (в зависимости от диаметра покровного стекла) разведённого раствора вторичных антител в PBT (примечание 15) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
6. Промывание
Покровные стёкла извлекают из влажной камеры. Раствор антител удаляют пипеткой, после чего край покровного стекла прикасают к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла переносят в чистую чашку Петри с PBS (примечания 13, 16, 17) и инкубируют не менее 5 минут при комнатной температуре (3 раза).
7. Монтирование, хранение, стабильность
В завершение покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBS удаляют, прикасаясь краем покровного стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла монтируют с использованием выбранной среды для монтирования. Дополнительно смонтированные покровные стёкла могут быть полностью или точечно зафиксированы с помощью лака для ногтей (примечания 18, 19).
Трёхцветное конфокальное изображение культивируемых клеток млекопитающих, фиксированных формальдегидом и меченных фаллоидином с abberior STAR GREEN, а также иммуномеченных ядерных пор (Nup153, abberior STAR 580) и пероксисом (PMP70, abberior STAR RED).
8. Хранение образцов
Готовые образцы следует хранить при температуре 4 °C (примечание 21). Большинство образцов стабильно в течение ограниченного времени. Для получения наилучших результатов (рис. 5) визуализацию образцов рекомендуется проводить в течение одной недели после приготовления.
Протокол III
Фаллоидиновое мечение культивируемых адгезивных клеток млекопитающих — фиксация формальдегидом
1. Культивирование клеток
Клетки, как правило, высеивают на покровные стёкла за 12–36 часов до проведения мечения (примечания 3, 4).
2. Фиксация, экстракция и блокирование
Образцы фиксируют раствором формальдегида, располагая клетки вверх (примечания 5, 6, 7, 8, 9, 10), в течение 5 минут. Затем проводят экстракцию клеток с использованием 0,1–0,5 % Triton X-100 в PBS (примечание 11) также в течение 5 минут. После этого покровные стёкла промывают PBS (примечания 12, 13). В завершение неспецифические сайты связывания блокируют раствором PBT не менее 15 минут при комнатной температуре (RT) в чашке Петри (примечание 14).
3. Инкубация с флуорофорно-меченным фаллоидином
Покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBT удаляют, прикасаясь краем покровного стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла помещают во влажную камеру, наносят 25–100 мкл (в зависимости от диаметра покровного стекла) разведённого раствора фаллоидина в PBT (примечание 15) и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре.
4. Промывание
Покровные стёкла извлекают из влажной камеры. Раствор фаллоидина удаляют пипеткой, после чего край покровного стекла прикасают к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла переносят в чистую чашку Петри с PBS (примечания 13, 16) и инкубируют не менее 5 минут при комнатной температуре (2 раза).
5. Монтирование, хранение, стабильность
В завершение покровные стёкла извлекают из чашки Петри; избыток PBS удаляют, прикасаясь краем покровного стекла к фильтровальной бумаге. Затем покровные стёкла монтируют с использованием выбранной среды для монтирования. Дополнительно смонтированные покровные стёкла могут быть полностью или точечно зафиксированы лаком для ногтей (примечания 18, 19).
6. Хранение образцов
Готовые образцы следует хранить при температуре 4 °C (примечание 21). Большинство образцов стабильно в течение относительно короткого времени. Для получения наилучших результатов (рис. 5, 6) визуализацию образцов рекомендуется проводить не позднее чем через одну неделю после приготовления.
Примечания
Основное правило при иммуномечении — образцы не должны высыхать на любом этапе процедуры.
- Растворение флуорофорно-меченного фаллоидина. Содержимое флакона следует растворить до конечной концентрации 200 ед./мл, что соответствует приблизительно 6,6 мкМ.
- Некоторые среды для монтирования могут влиять на фотофизические свойства отдельных флуорофоров, приводя, например, к изменению яркости и фотостабильности. Также возможны сдвиги спектров возбуждения и эмиссии.
- При необходимости высев клеток может быть выполнен раньше. В зависимости от времени удвоения, длительности культивирования, плотности клеток и других факторов клетки могут образовывать микроколонии.
- Клетки, выращенные при очень высокой плотности (сплошной конфлюэнтный слой), могут приводить к повышенному фоновому сигналу при визуализации.
- В отличие от других протоколов, перед фиксацией образцы/клетки не промывают буфером или аналогичными растворами.
- Перед фиксацией клетки не подвергаются предварительной экстракции.
- Фиксацию проводят с использованием избытка фиксирующего раствора.
- Для фиксации покровные стёкла помещают в чистую чашку Петри, содержащую фиксатор. В качестве альтернативы фиксация может проводиться в той же чашке Петри, в которой выращивались клетки.
- Перед фиксацией питательная среда полностью удаляется, после чего клетки полностью погружаются в фиксатор.
- Фиксацию следует проводить с использованием свежеприготовленного или предварительно замороженного фиксатора. Предпочтительно использовать предварительно подогретый фиксатор. Готовые растворы 37 % формальдегида в метаноле использовать не рекомендуется.
- Между фиксацией и блокированием может потребоваться этап экстракции. При фиксации формальдегидом экстракция детергентами является критически важной. Для клеток, фиксированных метанолом, экстракция не требуется, однако кратковременная промывка PBS с 0,1 % Triton X-100 может улучшить качество мечения.
- Покровные стёкла с фиксированными клетками могут храниться 1–2 дня при 4 °C в PBS. Однако хранение может негативно повлиять на качество мечения.
- Промывание следует выполнять с использованием избытка PBS.
- Блокирование следует проводить с использованием избытка раствора PBT.
- При инкубации с антителами покровные стёкла не следует размещать клетками вниз на парафильме или аналогичных плёнках. Несмотря на возможное снижение расхода антител, клетки могут повреждаться при снятии стекла с поверхности.
- После инкубации с антителами покровные стёкла следует промывать в разных чашках Петри во избежание перекрёстной контаминации.
- При высоком фоне мечения его можно дополнительно снизить инкубацией в PBS с Triton X-100 и/или в растворе PBT.
- При использовании неотверждаемых монтирующих сред покровные стёкла необходимо герметизировать с помощью Twinsil или лака для ногтей.
- При использовании TDE в качестве монтирующей среды Twinsil применять нельзя, так как TDE препятствует его полимеризации и отверждению.
- Использование TDE невозможно для образцов, меченных фаллоидином.
- Хранение образцов при −20 °C следует избегать, поскольку образование кристаллов льда может ухудшить качество образцов.
Сокращения
|
Сокращение |
Расшифровка |
|
BSA |
Бычий сывороточный альбумин |
|
DMF |
N,N-диметилформамид |
|
DMSO |
Диметилсульфоксид |
|
PBS |
Фосфатно-солевой буфер |
|
PBT |
PBS / BSA / Tween 20 |
|
RT |
Комнатная температура |
|
SDS |
Додецилсульфат натрия |
|
STED |
Stimulated Emission Depletion (подавление вынужденного излучения) |
|
TDE |
2,2′-тиодиэтанол |
