Фибробласты опосредуют реакцию эндотелия на ангиогенные сигналы в новой разработанной 3D-модели стромы, созданной методами тканевой инженерии
Современные методы тканевой инженерии позволяют создавать трёхмерные модели тканей человека, приближённые к физиологическим. Однако большинство таких моделей до сих пор не имеют двух ключевых элементов: сосудистой сети, необходимой для транспорта газов и питательных веществ, и микроокружения ткани — стромы.
Именно в строме, состоящей из фибробластов, внеклеточного матрикса и других компонентов, происходят важные процессы ремоделирования, включая ангиогенез — образование новых сосудов из существующих. Ангиогенез играет центральную роль при раке, ишемии, ретинопатиях и заживлении ран. Тем не менее, влияние многих про- и антиангиогенных факторов на взаимодействие эндотелия со стромой остаётся недостаточно изученным.
Существующие in vitro модели (например, organ-on-chip) имеют серьёзные ограничения: использование синтетических материалов, не соответствующих механическим свойствам тканей, культивирование только эндотелиальных клеток без стромы и отсутствие истинной трёхмерной пространственной организации.
Трехмерная модель васкуляризированной стромы, методы визуализации
Авторы впервые создали гетеротипическую платформу, в которой фибробласты и эндотелиальные клетки находятся в разных, но функционально связанных компартментах внутри одного 3D-пористого скаффолда из природных биополимеров — пуллулана и декстрана. В пористый скаффолд с предварительно сформированными микроканалами диаметром 100 мкм они поместили фибробласты в поры матрикса, а эндотелиальные клетки — внутрь каналов, где те сформировали сосудистый просвет.
Разработанный метод производства позволил получить матрицы с физическими свойствами, максимально приближенными к нативной ткани, а двухэтапная процедура посева обеспечила перекрёстное взаимодействие клеток без их смешивания. Модель использовали для тестирования ответа на проангиогенные (гипоксия, L-аргинин) и антиангиогенные (бевацизумаб) стимулы в сравнении с сосудистой монокультурой.
Изготовление 3D-модели васкуляризированной стромы и маркеры для сокультивирования
Высокая плотность клеток и накопление внеклеточного матрикса со временем делали скаффолд непрозрачным. Это затрудняло глубокий анализ внутренних микроструктур. Хотя гистологические процедуры (нарезка тканей) были адаптированы для биоматериалов, они часто приводят к деформации образца. В случае матриц из пуллулана/декстрана при нарезке структура разрушается, что может привести к неверной интерпретации 3D-расположения клеток. Поэтому авторы отказались от нарезки тканей и обратились к методам оптической визуализации целых образцов.
Для визуализации разработанной 3D-модели авторы использовали комплекс методов микроскопии, включая конфокальную микроскопию, двухфотонную микроскопию, макроскопию, а также микроскопию светового листа (Lightsheet Microscopy). Визуализацию методом Lightsheet Microscopy выполняли на системе Alpha3 (PhaseView, Франция), оснащённой объективом для просветления 10× XL Plan N (Olympus, Япония) с регулируемым колпачком для показателя преломления (диапазон RI 1.33–1.52) и камерой sCMOS Orca Flash4 (Hamamatsu, Япония). В сочетании с адаптированным авторами протоколом оптического просветления UbasM это позволило достичь глубины визуализации до 900 мкм, что в 4 раза превышает возможности стандартной конфокальной микроскопии на непросветлённых образцах. Lightsheet-микроскопия применялась параллельно с другими методами, что дало возможность провести мультимасштабную характеристику модели — от макро до микро уровня. Благодаря оптическому просветлению и lightsheet-микроскопии авторы получили возможность визуализировать интактные (неразрезанные) образцы, получая репрезентативные данные о клеточном поведении и ремоделировании матрикса без артефактов, связанных с нарезкой.
Применение этого подхода позволило получить важные результаты. Сравнив сосудистую монокультуру (только эндотелий) и полную строму (эндотелий + фибробласты), авторы обнаружили:
- Совместное присутствие фибробластов повышает жизнеспособность эндотелия, его метаболическую активность и выработку сигнальных молекул (цитокинов).
- Защитная роль фибробластов. При воздействии про- и антиангиогенных стимулов фибробласты снизили токсичность:
- В монокультуре (без фибробластов) противораковый препарат бевацизумаб вызвал гибель более 80% клеток.
- В совместной культуре (с фибробластами) — гибель ниже 30%.
- Фибробласты помогли восстановить нормальный уровень оксида азота (важного регулятора сосудов) и поддерживали экспрессию эндотелиальных маркеров (белков CD31, vWF и VEGF), которые необходимы для здоровой функции сосуда.
- Функциональность сосуда. Сформированный сосуд в совместной культуре обладал барьерной функцией: он снижал проницаемость для тестового вещества (декстрана) в 2 раза по сравнению с пустым каналом.
Формирование сосуда в полной строме
Таким образом, созданная 3D-модель васкуляризированной стромы на основе пуллулана/декстрана с предварительно сформированными микроканалами позволяет в лабораторных условиях изучать перестройку (ремоделирование) стромы при ангиогенезе — ключевом механизме метастатического рака, болезней сетчатки и ишемии, а также тестировать потенциальные методы терапии.
Главное технологическое достижение — адаптация протокола оптического просветления UbasM, которая впервые позволила выполнить трёхмерную объёмную визуализацию модели на глубину до 1 мм без разрушения образца с помощью микроскопии светового листа.
Полученные результаты подчёркивают защитную роль фибробластов в отношении сосудистой сети и демонстрируют способность модели физиологически (похоже на живой организм) отвечать на внешние стимулы. Это открывает возможность её использования для тестирования ангиогенных препаратов и изучения механизмов стромального ремоделирования.
3D-визуализация стромы после обработки по методу UbasM. Ткань стала прозрачной, видны глубинные структуры
[1] Alessandra Dellaquila, Chlo´e Dujardin, Chau Le Bao, et al. Fibroblasts mediate endothelium response to angiogenic cues in a newly developed 3D stroma engineered model, Biomaterials Advances 154 (2023) 213636
