MINSTED - визуализация флуоресцентных молекул с нанометровым разрешением
"20 лет назад мы коренным образом преодолели дифракционный предел разрешения флуоресцентной микроскопии с помощью STED. До того момента это считалось невозможным", - говорит профессор Хэлл. "Тогда мы мечтали: с помощью STED мы хотим стать настолько искусными, что однажды сможем разрешать отдельные молекулы, находящиеся на расстоянии всего нескольких нанометров друг от друга. Теперь нам это удалось". В то время принцип STED стал революцией в световой микроскопии. За этот инновационный подход и последующие разработки Хэлл получил Нобелевскую премию по химии в 2014 году.
Сравнение разрешающей способности различных методов световой микроскопии: STED (слева внизу) резко повышает четкость деталей по сравнению с обычной конфокальной микроскопией (слева вверху). MINSTED (справа) достигает разрешения, которое еще в десять раз выше. Показаны флуоресцентно меченые белки (Mic60) в митохондриях клетки. (Образцы предоставлены С. Штольдтом и С. Якобсом). Масштабная линейка соответствует 100 нанометрам. © MPI for Biophysical Chemistry/ Michael Weber
В своей исходной версии микроскопия STED достигала разрешения от 20 до 30 нанометров и, таким образом, была примерно в десять раз четче, чем световые микроскопы, доступные на тот момент. В 2016 году Хэлл и его коллеги смогли еще в десять раз увеличить разрешение с помощью нового метода под названием MINFLUX-наноскопия. В рамках нового подхода они объединили элементы STED метода с элементом из другой техники световой микроскопии, PALM/STORM, и таким образом впервые достигли разрешения всего в несколько нанометров. MINFLUX действительно может сделать флуоресцентные молекулы видимыми в молекулярных масштабах - четче уже не бывает.
Новое семейство микроскопов с нанометровым разрешением
Хэлл был убежден, что MINFLUX не останется единственным методом молекулярного разрешения, а скорее станет первым членом нового семейства методов с таким уровнем детализации. С помощью MINSTED он и его коллеги сейчас доказывают, что это действительно так. Как следует из названия, MINSTED опирается на оригинальный принцип STED даже больше, чем MINFLUX. Подробнее об этом говорит Майкл Вебер, аспирант в лаборатории Хэлла и один из разработчиков MINSTED: "В этом есть свои преимущества. Как и в MINFLUX, здесь достигается молекулярное разрешение, но фоновый шум ниже. Кроме того, разрешение теперь можно регулировать практически непрерывно от 200 нанометров до молекулярного размера - 1 нанометр".
В MINSTED Хэлл опирается на свой прорыв, сделанный более 20 лет назад в STED, и извлекает весь потенциал из этой концепции. "Микроскопия в молекулярном масштабе не заставит себя ждать. Следует ожидать, что MINSTED и MINFLUX найдут широкое применение в науках о жизни", - заявляет Хэлл.
"Включение" и "выключение" флуоресценции молекул
STED добился ранее недостижимого - раздельного детектирования молекул, находящихся на расстоянии менее 200 нанометров друг от друга, с помощью одной уловки: соседние флуоресцентные элементы или молекулы "включаются" и "выключаются" одна за другой. Для этого за лазерным лучом, возбуждающим молекулы, сразу же следует второй, так называемый STED-луч, который не дает молекулам флуоресцировать. Луч STED, впрочем, имеет "дыру" в середине. Другими словами, он имеет форму «пончика». Только молекулы в центре этого пучка могут флуоресцировать. Таким образом, всегда известно, где находятся излучающие молекулы. На практике STED не позволяет достичь молекулярного разрешения, поскольку пучок подавления флуоресценции в форме «пончика» нельзя сделать настолько сильным, чтобы в отверстие поместилась только одна молекула.
По этой причине в MINSTED флуоресцентные молекулы изначально изолируются путем случайного включения с помощью независимого фотохимического процесса переключения, а не с помощью самого луча в форме "пончика". Затем кольцеобразный луч STED, препятствующий флуоресценции, используется для индивидуальной локализации флуоресцентных молекул. Его отверстие служит точкой отсчета. "Если отверстие совпадает с молекулой, молекула светится сильнее всего, и вы можете точно определить, где она находится, потому что точное положение пучка STED всегда известно", - говорит Марсель Лейтенеггер, старший научный сотрудник из отдела Хэлла. Поэтому мы постепенно целенаправленно приближаемся к молекулам с помощью луча в форме «пончика» и таким образом можем определить местонахождение флуоресцентных молекул с точностью от 1 до 3 нанометров, то есть с разрешением размера молекул. В сочетании с фотохимическим включением и выключением разрешение становится молекулярным".
