Арт. Mizar TILT
Введение
Обычная флуоресцентная микроскопия использует высокоинтенсивный луч света для освещения образца, но он возбуждает все флуорофоры находящиеся на пути прохождения света, а не только интересующую плоскость исследуемого образца. В результате свет, излучаемый из областей вне фокальной плоскости, вносит свой вклад в получаемое изображение. Конфокальная микроскопия решает эту проблему, используя точечные отверстия (пинхолы), чтобы выборочно собирать свет только из интересующей плоскости образца. Однако высокоинтенсивный свет проникает через весь образец, что вызывает его фотообесцвечивание и фотоповреждение.
Флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения (Light Sheet Fluorescence Microscopy - LSFM) или селективная микроскопия плоскостного освещения (Selective Plane Illumination Microscopy - SPIM) освещает только интересующую плоскость образца, что позволяет нам собирать информацию из одной плоскости, а также сводит к минимуму фотообесцвечивание и фотоповреждение остальной части образца. Устраняя таким образом расфокусированный свет, можно использовать меньшую интенсивность света для возбуждения образца, что дополнительно способствует снижению фотообесцвечивания и фотоповреждений и позволяет нам получать изображения в течение длительных периодов времени. Поэтому с помощью метода микроскопии плоскостного освещения можно получить больше экспозиций, чем при любой другой форме флуоресцентной микроскопии.
Обычный метод LSFM микроскопии выполняется с двумя объективами, расположенными ортогонально друг другу, так что один объектив вводит луч плоскостного освещения в образец, а другой объектив регистрирует флуоресцентный сигнал. Однако такая ориентация объективов требует, чтобы объектив регистрации флуоресценции был расположен немного в стороне от образца, чтобы предотвратить столкновение двух объектов в пространстве. Следовательно, необходим объектив для регистрации с большим рабочим расстоянием, что означает, что масляные иммерсионные объективы с высокой числовой апертурой несовместимы с традиционной конструкцией метода LSFM микроскопии.
Это представляет проблему для обнаружения клеточных или субклеточных структур, которые требуют использования объектива регистрации флуоресценции с высокой числовой апертурой для достижения превосходного разрешения и эффективного сбора света. Визуализация этих клеточных структур затруднена с помощью обычного метода LSFM микроскопии и может быть достигнута только с помощью метода SPIM микроскопии с несколькими проекциями с объективом с числовой апертурой 1.2 NA и последующей деконволюцией - невероятно трудоемким процессом.
Система Mizar TILT для микроскопии плоскостного освещения устраняет эту проблему, удаляя объектив освещения из конструкции микроскопа и вводя наклоненное плоскостное освещение через фотошаблон и цилиндрическую линзу, которые могут быть выполнены таким образом, чтобы иметь возможность сходиться на рабочем расстоянии объективов с высокой числовой апертурой. Таким образом, масляные иммерсионные объективы с большим увеличением и высокой числовой апертурой (60x, NA 1,49) могут быть использованы для получения изображения образцов, собранных на покровном стекле. TILT система может использоваться с большинством существующих прямых или инвертированных микроскопов и не требует вычислительной реконструкции для просмотра изображения.
Принцип работы Mizar Tilt
Система TILT для микроскопии плоскостного освещения была создана Полом Мэддоксом в Университете Северной Каролины как способ сочетающий низкое фотообесцвечивание и фотоповреждение метода LSFM микроскопии с высоким увеличением и высоким значением числовой апертуры масляных иммерсионных объективов для клеточной и субклеточной визуализации. Mizar Tilt производится и распространяется компанией Cairn Research. В обычном методе LSFM микроскопии положение объектива приводит к появлению луча света, который сходится вне объектива регистрации, что требует использования объектива регистрации с большим рабочим расстоянием. Эти объективы обычно имеют малое увеличение и низкую числовую апертуру (рис. 1, вверху).
Принцип, лежащий в основе TILT системы для LSFM микроскопии - это метод, известный как наклонное возбуждение боковой интерференции (Lateral Interference Tilted Excitation - LITE). В этом методе лазерный луч сначала коллимируется в радиально-симметричный луч диаметром 22 мм. Коллимированный свет затем пропускается через фотошаблон и цилиндрическую линзу, которая фокусирует свет в луч, имеющий приблизительно форму прямоугольной призмы. Цилиндрическая линза фокусирует луч вдоль одной оси, чтобы сформировать недифрагирующую плоскость освещения, которая затем наклоняется так, что нижняя часть луча параллельна фокальной плоскости объектива регистрации флуоресценции. Фотошаблон помещается перед цилиндрической линзой для создания интерференционной картины, которая удлиняет длину плоскости освещения. Таким образом, плоскостное освещение формируется на рабочем расстоянии линз с большим увеличением и большой числовой апертурой (рис. 1, снизу).
Рисунок 1. Обычная LSFM микроскопия по сравнению с TILT микроскопией. Сверху: в обычной LSFM микроскопии объектив возбуждения вводит луч света, который сходится на некотором расстоянии от объектива регистрации флуоресценции. Это требует использования объектива с меньшей числовой апертурой и большим рабочим расстоянием до изображения. Внизу: при TILT микроскопии луч света наклоняется таким образом, чтобы сходиться непосредственно над объективом регистрации, что позволяет использовать объектив с высокой числовой апертурой и малым рабочим расстоянием.
Преимущества Mizar Tilt
Основным преимуществом системы Mizar TILT является использование достоинств метода LSFM микроскопии для визуализации клеточных и субклеточных структур. Обычная и конфокальная микроскопия являются бесценными инструментами для исследования клеточной биологии, но с помощью микроскопии с использованием плоскостного освещения возможно гораздо более длительное получение данных из-за значительного снижения фотообесцвечивания и фотоповреждений. Объективы с более высокой числовой апертурой также более эффективны для передачи и сбора света, чем обычные объективы в LSFM микроскопии, а это означает, что можно использовать даже более низкую интенсивность света освещения, еще больше снижая фотообесцвечивание и фотоповреждения. Это обстоятельство позволяет биологам следить за клеточными процессами в течение гораздо более длительного периода времени, чем это было возможно ранее.
Система Mizar TILT универсальна с точки зрения необходимого дополнительного оборудования. Она может быть установлена на большинство прямых или инвертированных микроскопов с любыми лазерными источниками различных длин волн и камерами. Это означает, что любой пользователь, у которого есть микроскоп, может адаптировать его к системе микроскопии плоскостного освещения с высоким разрешением. Поскольку система Mizar TILT монтируется на микроскопе, ее также можно одновременно использовать с дифференциально-интерференционной контрастной микроскопией (DIC) или другими инструментами для микроскопии. Кроме того, нет необходимости в специальных режимах работы камеры или дополнительных функциях, что делает систему очень простой для реализации на существующем оборудовании.
Кроме того, система Mizar TILT позволяет располагать образцы на покровных стеклах, что является предпочтительным способом для биологов, поэтому не требуется никаких дополнительных технических знаний для подготовки образцов. Также нет необходимости в сложной программной деконволюции восстановления изображения после получения данных.
Система Mizar TILT позволяет получить живое изображение 3D-клеточных культур, сфероидов и кист, тканей и органотипических культур, быструю визуализацию клеточной динамики в эмбрионах и мелких организмах, например, миграция клеток, сердечное развитие, кровоток, развитие сосудов.
Выбор камеры для Mizar Tilt
С системой Mizar TILT можно использовать любую камеру, но мы считаем, что наилучшей производительности можно достичь с использованием sCMOS камеры c 95% квантовой эффективностью и сенсором с обратной засветкой - Sona от компании Andor.
Почти идеальный, с 95% квантовой эффективности (QE) sCMOS сенсор позволяет еще больше снизить интенсивность света при сохранении высокого уровня обнаружения сигнала. Эта особенность идеально подходит для образцов, которые необходимо отслеживать в течение очень длительного периода времени без фотообесцвечивания, а также для образцов, которые особенно чувствительны к фотоповреждениям. По сравнению со стандартными sCMOS камерами время экспозиции на камере Andor Sona может быть уменьшено в четыре раза и при этом обеспечить эквивалентное обнаружение флуоресценции.
Камера Andor Sona также имеет большое поле зрения (диагональ 32 мм) и высокую скорость (48 кадров в секунду, полный кадр), ожидаемые от CMOS камер. Это позволяет отображать большие образцы без сшивания изображения.
Большие пиксели размером 11x11 мкм камеры Andor Sona обеспечивают дополнительную чувствительность и обладают большой емкостью электронной ямы 85 000 e- с низким шумом считывания 1,6 е-, что обеспечивает камере Andor Sona очень высокий динамический диапазон, идеальный для получения высококонтрастных изображений. Пиксели большего размера дополняют объективы с высоким увеличением и большой числовой апертурой, что позволяет получать изображения с высоким разрешением.
