Арт. STRED
Многоцветная визуализация клеток и тканей необходима для решения многих вопросов биомедицинских исследований. Из-за небольшого размера многих субклеточных органелл их структуры и динамические взаимодействия могут быть визуализированы и проанализированы только с помощью световой микроскопии сверхвысокого разрешения. Микроскопия со стимулированным эмиссионным девозбуждением (STED) является одним из таких методов, который позволяет получать многоцветные изображения сверхвысокого разрешения в фиксированных (Hell et al. 1994; Saal et al. 2017) и живых клетках (Stockhammer and Bottanelli, 2020). Многоцветная визуализация STED была продемонстрирована в фиксированных клетках, предоставляя полезную биологическую информацию, но не позволяя изучать клеточную динамику. Самой большой проблемой для многоцветной STED-визуализации живых клеток было отсутствие подходящих комбинаций красителей и щадящих процедур визуализации. Краситель Abberior LIVE 460L преодолевает это препятствие. Этот краситель со сдвигом Стокса оптимизирован для STED и легко комбинируется с несколькими красителями для живых клеток в трехцветной визуализации живых клеток.
- abberior LIVE 460L и STAR 460L — это красители с длинным Стокс-сдвигом, оптимизированные для STED-микроскопии.
- комбинация abberior LIVE 460L с красителями STED, излучающими в красном и дальнем красном спектрах, позволяет получать многоцветные изображения STED живых клеток.
Стратегии многоцветной STED-визуализации
За последние несколько десятилетий было предложено несколько стратегий многоцветной STED-визуализации. Первая реализация этого метода позволила получить двухцветное изображение, полагаясь на пары пучков возбуждения и STED с разными длинами волн, подходящими для красителей, присутствующих в образце (Donnert et al. 2007; Bückers et al. 2011). Чтобы расширить эту концепцию до трех цветов, популярная линия девозбуждения 775 нм для красных и дальнекрасных меток часто сочетается с линией девозбуждения 595 нм для зеленых флуоресцентных белков, таких как GFP, YFP или mNeonGreen (один из самых ярких флуоресцентных белков в области зеленого спектра). Несмотря на эффективность, использование STED-лазера в желтом спектре может привести к повышению фототоксичности живых клеток (Wäldchen et al. 2015). Кроме того, использование двух длин волн STED требует последовательного сканирования. Красные флуорофоры с красным смещенным возбуждением и лазеры STED должны быть отображены в первую очередь, прежде чем зеленые флуорофоры, основанные на длинах волн с зеленым смещением. Это связано с тем, что STED-лазер со сдвигом в зеленый цвет может возбуждать и фотообесцвечивать красные флуорофоры. В конечном итоге это сокращает визуализацию до одной временной точки и продлевает время визуализации.
Позже была создана двухцветная (Göttfert et al. 2013) и многоцветная (Winter et al. 2017) STED-визуализация с помощью одного STED-лазера. Здесь спектрально разные флуорофоры возбуждались разными линиями возбуждения и детектировались в спектрально сходных окнах детектирования. Однако все они были де-возбуждены с помощью одного и того же лазера STED. Основным преимуществом этой стратегии является присущее совмещение цветовых каналов.
Эту стратегию можно распространить на другие каналы. В дополнение к упомянутой выше комбинации обычных флуорофоров с узкими полосами возбуждения и испускания можно использовать красители с длинно-стоксовым сдвигом, которые демонстрируют очень широкое расстояние или спектральный сдвиг между их спектрами возбуждения и испускания. На практике их комбинируют с обычными флуорофорами красного и дальнего красного диапазона. Комбинированные красители последовательно возбуждаются лазерами с разными длинами волн, но все они затем обрабатываются только с помощью одного STED-лазера. Это делает их подходящими для применения в многоцветной STED-микроскопии.
abberior STAR 460L для многоцветной визуализации с красителями с длинным Стоксовым сдвигом
Компания Abberior теперь предлагает новый краситель с длинно-стоксовым сдвигом под названием Abberior STAR 460L. Краситель наиболее эффективно возбуждается в диапазоне 440–490 нм и излучает в диапазоне 560–680 нм, допуская девозбуждение в диапазоне 750–800 нм (рис. 2). Эти характеристики делают Abberior STAR 460L оптимальным красителем для многоцветных STED-экспериментов с использованием одной длины волны STED. Действительно, для трехцветной STED-визуализации в фиксированных клетках Abberior STAR 460L можно комбинировать с Abberior STAR RED и Abberior STAR ORANGE, и все три красителя можно обрабатывать с помощью STED лазера на 775 нм.
Рис. 1. Комбинации красителей для многоцветной STED-визуализации
В таблице показаны подходящие комбинации красителей для трехцветного окрашивания фиксированных клеток (красители Abberior STAR) и живых клеток (красители Abberior LIVE) с возбуждением и STED-обработкой. Спектры возбуждения Abberior STAR460L показывают, что краситель наиболее эффективно возбуждается в диапазоне 440–490 нм и, следовательно, может комбинироваться с Abberior STAR ORANGE (возбуждается в диапазоне 550–610 нм) и Abberior STAR RED (возбуждается в диапазоне 630-650 нм). Эти характеристики позволяют снять возбуждение с помощью одного STED-лазера в диапазоне 750–800 нм.
Рис. 2. Комбинации красителей для многоцветной STED-визуализации
Конфокальная визуализация с использованием Abberior STAR 460L
Для трехцветной визуализации фиксированные клетки млекопитающих окрашивали красителем Abberior STAR 460L, приспособленным для тубулина, красителем Abberior STAR RED для комплекса ядерных пор, и красителем Abberior STAR ORANGE для виментина. Затем образцы визуализировали с помощью микроскопа Abberior STEDYCON в конфокальном режиме. Краситель STAR 460L возбуждался при 488 нм и обнаруживался в диапазоне 575–625 нм, краситель STAR RED возбуждался при 640 нм и обнаруживался в диапазоне 650–700 нм, а краситель STAR ORANGE возбуждался при 561 нм и обнаруживался в диапазоне 575 - 625 нм. На конфокальном изображении не было видно перекрестных помех в отдельных каналах (рис. 3), несмотря на то что окна обнаружения STAR 460L и STAR ORANGE были одинаковыми.
Рис. 3. Многоцветное конфокальное изображение с красителем Abberior STAR 460L. Фиксированные клетки млекопитающих окрашивали красителем Abberior STAR 460L для визуализации тубулина (TUB), красителем Abberior STAR RED для выявления комплекса ядерных пор (NUP) и красителем Abberior STAR ORANGE для окрашивания виментина (VIM). Конфокальные изображения были получены с помощью STEDYCON в конфокальном режиме.
STED-визуализация с использованием Abberior STAR 460L
Также были проверены характеристики и поведение красителя Abberior STAR 460L в STED-микроскопии. Образцы готовили, как описано под рис. 3, и визуализировали с помощью микроскопа Abberior STEDYCON в режиме STED. Как и прежде, перекрестных помех между отдельными каналами на STED-изображениях обнаружено не было (рис. 4).
Рис. 4. Многоцветное STED-изображение с красителем Abberior STAR 460L. Фиксированные клетки млекопитающих окрашивали, как и в случае конфокальной микроскопии. STED-изображения получали с использованием STEDYCON в режиме STED.
Эти результаты показывают, что многоцветная конфокальная и STED-визуализация без перекрестных помех легко достигается при использовании Abberior STAR 460L в сочетании с STED-совместимыми красителями для красного и дальнего красного диапазонов, такими как Abberior STAR RED и Abberior STAR ORANGE.
Многоцветная визуализация живых клеток с помощью Abberior LIVE 460L
Двухцветная визуализация STED живых клеток была продемонстрирована с использованием методов мечения на основе SNAP-tag® (Pellett et al. 2011). SNAP-метки® представляют собой генетически кодируемые белковые метки, которые можно комбинировать с проникающими в клетку (и, следовательно, совместимыми с живыми клетками) органическими флуорофорами. Поэтому они хорошо подходят для визуализации живых клеток (со сверхвысоким разрешением). В целом, многоцветная визуализация со сверхвысоким разрешением может дать более четкое представление о пространственном распределении двух или более белков. В живых клетках дополнительным преимуществом является то, что взаимодействие между этими белками можно изучать в режиме реального времени. В то время как трехцветная визуализация STED в фиксированных клетках относительно проста, аналогичные эксперименты с живыми клетками оказались сложной задачей. И все же многоцветная визуализация живых клеток со сверхвысоким разрешением необходима для полного понимания биологических процессов (Pellett et al. 2011).
Одним из основных узких мест, препятствующих применению трехцветной STED-визуализации в живых клетках, является отсутствие подходящих флуорофоров. Чтобы помочь преодолеть это препятствие, компания Abberior разработала краситель Abberior LIVE 460L, новый краситель с длинно-стоксовым сдвигом, оптимизированный для STED и визуализации живых клеток. Стоит отметить, что LIVE 460L можно легко комбинировать с красителями живых клеток в красном и дальнем красном диапазоне для получения трехцветного изображения (см. рис. 1), благодаря длинностоксовому смещению LIVE 460L и все три красителя можно визуализировать с помощью STED с одной длиной волны, что, в свою очередь, гарантирует изначальное выравнивание всех цветовых каналов. Кроме того, это устраняет необходимость в последовательном сканировании, что сводит к минимуму фотообесцвечивание и фототоксичность.
Чтобы продемонстрировать многоцветную визуализацию живых клеток со сверхвысоким разрешением, клетки млекопитающих окрашивали с помощью Abberior LIVE 460L для визуализации митохондрий, Abberior LIVE 610 для выявления тубулина и abberior LIVE 550 для окрашивания актина (рис. 5). Окрашенные клетки поддерживали в среде DMEM GFP без фенолового красного (DMEMg-fp-2, Evrogen) и визуализировали с помощью Abberior STEDYCON.
Красители Abberior LIVE 460L, Abberior LIVE 610 и abberior LIVE 550 представляют собой идеальную комбинацию для трехцветной микроскопии живых клеток. Все три красителя могут быть деактивированы одновременно с помощью одного и того же STED-лазера с длиной волны 775 нм. Эта процедура в сочетании с превосходной яркостью и фотостабильностью красителей Abberior LIVE позволяет получать изображения с высоким разрешением, сохраняя при этом клетки живыми и здоровыми для длительных интервальных измерений.
Рисунок 5: Многоцветное STED-изображение с красителем Abberior LIVE 460L. Живые клетки млекопитающих окрашивали красителем Abberior STAR 460L для визуализации митохондрий (желтый), красителем Abberior LIVE 610 для выявления тубулина (голубой) и красителем Abberior LIVE 550 для окрашивания актина (серый). Изображения были получены с помощью STEDYCON.
Для обеспечения широкого спектра применений новый краситель с длинно-стоксовым сдвигом 460L доступен в виде красителя Abberior STAR, конъюгированного с различными вторичными антителами, стрептавидином, фаллоидином или нейтравидином, или в виде проникающего в клетки красителя Abberior LIVE, конъюгированного с джасплакинолидом для окрашивания актина или Hoechst для маркировки ДНК. Кроме того, Abberior LIVE 460L также доступен в виде SNAP-tag®- реакционно-способного лиганда.
Этот широкий спектр производных красителей позволяет создавать различные комбинации с различными красителями Abberior STAR и Abberior LIVE для различных многоцветных конфигураций. Использование красителей со длинно-стоксовым сдвигом обеспечивает простой в использовании подход к высококачественной трехцветной STED-визуализации фиксированных и живых клеток в мягких условиях визуализации. Это, в свою очередь, позволяет проводить точный анализ структуры, положения и динамических взаимодействий множества белков, а затем лучше понимать клеточные и молекулярные процессы в клетках.
