Арт. Celloger Pro
Введение
Цитокинез - это заключительный этап деления клетки, во время которого цитоплазма одной клетки физически разделяется на две отдельные клетки. Актиновые филаменты играют важнейшую роль в поддержании структуры клетки и облегчении деления. Непосредственно перед разделением клеток актиновые филаменты сжимают клеточную мембрану, что приводит к образованию двух дочерних клеток. [Pier Paolo D’Avino., et al. 2015]
Цитохалазин B, соединение, широко используемое в исследованиях клеточного деления и движения, существенно влияет на структуру и динамику актиновых филаментов. В первую очередь он препятствует цитокинезу, блокируя образование сократительных микрофиламентов. Интересно, что цитохалазин B, несмотря на то, что является одним и тем же препаратом, в разных концентрациях оказывает разное влияние на поведение клеток. В высоких концентрациях цитохалазин B вызывал изменения в морфологии клеток, включая сокращение актиновых канатиков, округление фибробластических клеток. [J. W. SANGER., 1974] Однако низкие концентрации цитохалазина B подавляли миграцию клеток и взъерошивание мембран, не вызывая значительных изменений в общей морфологии. [YAHARA, ICHIRO., et al. 1982] Кроме того, предыдущие исследования показали, что цитохалазин B может приводить к неполному делению клеток, в результате чего образуются многоядерные клетки. [Awtar Krishan., 1971] В этом приложении мы хотим продемонстрировать динамические изменения в структуре клеток при обработке цитохалазином B с помощью микроскопа Celloger® Pro.
Метод
Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие tdTomato-меченый актин, высевали в 24-луночный планшет при плотности 2,5x104 клеток на лунку. После ночной инкубации клетки обрабатывали цитохалазином B в концентрациях 1,25 мкМ (низкая концентрация) и 10 мкМ (высокая концентрация). Визуализация проводилась с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 10X с интервалом в 1 час в течение 48 часов. Наконец, клеточные ядра окрашивали 1 мкМ SYTO9 (Invitrogen, S34854) для всех групп, кроме группы с высокой концентрацией.
Результат
Чтобы понять динамические изменения и структурные характеристики актиновых филаментов, индуцированные цитохалазином B во время деления клеток, мы использовали клеточную линию HeLa, стабильно экспрессирующую tdTomato-меченый актин, и наблюдали за ней в режиме реального времени в течение 48 часов. Изображения были получены с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 10X и обрезаны для анализа. В контрольной группе клетки делились из двух клеток на четыре дочерние, претерпевая нормальное клеточное деление (рис. 1. Верхние изображения). Напротив, клетки, обработанные низкой концентрацией цитохалазина B, не смогли завершить разделение клеточных мембран, что привело к образованию нескольких ядер в одной клетке (рис. 1. Изображения в середине). Однако в клетках, обработанных высокими концентрациями цитохалазина B, наблюдалось сильное нарушение структуры актиновых филаментов, что привело к необратимому округлению клеток. (рис. 1. Нижние изображения). В количественном отношении в группе, обработанной низкой концентрацией цитохалазина В, наблюдается более высокое соотношение многоядерных клеток по сравнению с контрольной группой (рис. 2).
Рис. 1 Визуализация динамических изменений актина при обработке цитохалазином B различной концентрации
|
|
Клетки HeLa, обработанные цитохалазином B в концентрациях 0 мкМ (контроль, верхние изображения), 1,25 мкМ (низкая концентрация, изображения в середине) и 10 мкМ (высокая концентрация, нижние панели). Изображения клеток получали с помощью микроскопа Celloger® Pro с 10-кратным объективом с интервалом в 1 час. Через 48 часов ядра клеток окрашивали 1 мкМ SYTO9, за исключением группы с высокой концентрацией (изображения справа). Рисунок 2. Обработка низкой концентрацией цитохалазина В индуцировала появление многоядерных клеток. Количество общих клеток и клеток с двумя и более ядрами подсчитывали в 9 случайных точках в контрольной (n=564) и обработанной цитохалазином В (n=493) группах, соответственно. Соотношение многоядерных клеток рассчитывали как многоядерные клетки/общее количество клеток. ***P <0.001. |
Заключение
Актиновые филаменты в клетках играют важнейшую роль не только в клеточной структуре, но и в процессах репликации и деления клеток. Визуализация в реальном времени необходима для мониторинга различных клеточных движений и реакций на такие препараты, как цитохалазин B, известный тем, что ингибирует образование актиновых филаментов. В частности, когда речь идет о препаратах, проявляющих различные реакции при разных концентрациях, получение различных изображений для каждой концентрации может быть трудоемким. В данном исследовании мы эффективно использовали многопозиционные возможности микроскопа Celloger® Pro и удобную функцию смены объективов для наблюдения за динамикой актина при большом увеличении.
