Разработка конфокальной микроскопии стала ключевым этапом в развитии биологической визуализации. Почти каждый, кто работал с конфокальным микроскопом, согласится, что он даёт более качественные изображения, чем обычный широкопольный эпи-флуоресцентный микроскоп. Но почему? Из-за более высокого разрешения? Более чувствительных детекторов? Точечной лазерной подсветки? Некоторые скажут — из-за оптического секционирования. Но что это такое на самом деле? И чем отличается работа матричного детектора, такого как MATRIX, позволяющего добиться более эффективного подавления фонового сигнала?
На самом деле нет одной-единственной причины, по которой конфокальный микроскоп превосходит классический широкопольный. Здесь играет роль совокупность факторов. Разрешение конфокального микроскопа действительно выше, но самое главное — значительно улучшено оптическое секционирование. Оптическое секционирование — это способность формировать чёткое изображение фокальной плоскости, то есть той плоскости образца, на которую сфокусирован объектив микроскопа, подавляя при этом сигнал, исходящий из внефокусных областей.
Проще всего представить оптическое секционирование на примере простой структуры — например, двух клеточных мембран, расположенных одна над другой. Если одна мембрана находится точно в фокальной плоскости микроскопа, мы, в принципе, должны видеть её ярко и чётко. Но что происходит со второй мембраной, которая находится вне фокуса? При отсутствии оптического секционирования размытый свет от этой дефокусированной мембраны будет накладываться на сфокусированный сигнал от первой. В результате мы увидим обе мембраны одновременно и не сможем их различить. При идеальном оптическом секционировании, напротив, мембрана вне фокуса будет полностью тёмной, что резко снижает уровень фона на изображении.
Когда дело касается света, микроскописты привередливы
Оптическое секционирование в эпи-флуоресцентном микроскопе фактически равно нулю. Причина в том, что в любой момент времени освещается и регистрируется вся толщина образца. Флуорофоры, находящиеся вне фокуса, дают размытое, но не ослабленное по интенсивности свечение и потому полностью вносят вклад в нежелательный фоновый сигнал. Этот эффект похож на фотографирование камерой: объекты вне глубины резкости выглядят более размытыми, но не более тёмными.
Конфокальный микроскоп, напротив, ограничивает как освещение, так и регистрацию сигнала небольшой областью. Образец возбуждается сфокусированным лазерным пучком, интенсивность которого максимальна почти исключительно в фокальной плоскости (к слову «почти» мы ещё вернёмся). Кроме того, перед детектором установлен пинхол, который регистрирует возвращающийся от образца свет. Этот пинхол, в свою очередь, ограничивает регистрацию практически только фокальной плоскостью. Флуоресцентный свет, исходящий из областей выше или ниже фокуса, оказывается расфокусированным и не проходит через пинхол (рис. 1).
Рис. 1. Принцип оптического секционирования в конфокальном микроскопе. Возбуждающий свет (зелёный) сфокусирован в фокальной плоскости. Флуоресцентный свет (оранжевый), исходящий из фокальной плоскости, точно фокусируется на пинхоле и достигает детектора. Флуоресцентный свет из областей выше или ниже фокуса не попадает в пинхол и блокируется. На практике, однако, часть фонового сигнала всё же проходит через пинхол, что приводит к неидеальному оптическому секционированию.
Латеральное ограничение поля зрения за счёт освещения и регистрации лишь небольшой области имеет очевидный недостаток — примерно такой же, как если освещать рабочий стол лазерной указкой вместо лампы: в каждый момент времени освещается лишь крошечное пятно. Чтобы увидеть весь объект, необходимо перемещать это пятно, и микроскоп превращается в лазерно-сканирующую систему.
Тем не менее, это приемлемый компромисс, поскольку качество оптического секционирования значительно выше. В конфокальном микроскопе интенсивность флуоресценции быстро уменьшается с увеличением расстояния от фокальной плоскости — точнее, пропорционально квадрату этого расстояния. Удвоение расстояния молекулы от фокальной плоскости делает её в четыре раза более тусклой. Поэтому флуоресценция мембраны, сильно удалённой от фокуса, вносит лишь небольшой вклад в полезный сигнал и фон, что особенно важно при работе с толстыми образцами.
Чем меньше диаметр пинхола, тем эффективнее работает секционирование, но при слишком малом размере он начинает отсекать и значительную часть полезного сигнала из фокальной плоскости.
Световой лист и двухфотонная микроскопия
Существуют и другие способы формирования оптического среза. Например, можно оптимизировать освещение и попытаться ограничить его тонкой плоскостью — именно на этом основана светолистовая микроскопия. Однако по физическим причинам освещение при этом должно осуществляться сбоку. В результате усложняются размещение и фиксация образцов, а также приходится использовать объективы с низкой числовой апертурой. Поэтому, несмотря на свою полезность, светолистовая микроскопия не является универсальным решением.
Похожий подход используется в двухфотонной (или, в более общем случае, многофотонной) микроскопии, где возбуждение эффективно ограничено фокальной плоскостью. В этом случае флуорофор возбуждается не одним, а двумя фотонами с вдвое большей длиной волны по сравнению с однофотонным возбуждением. Эти два фотона должны одновременно попасть в одну и ту же молекулу флуорофора, что возможно только при высоких интенсивностях, присутствующих исключительно в фокусе. Вне фокальной области вероятность двухфотонного возбуждения крайне мала, и, как следствие, фоновый сигнал практически отсутствует. Таким образом, двухфотонная микроскопия обеспечивает очень хорошее оптическое секционирование и отлично подходит для глубинной визуализации тканей. Однако она требует дорогих лазеров, совместима не со всеми флуорофорами и характеризуется сравнительно слабым сигналом, низким аксиальным разрешением и невысокой скоростью съёмки. Поэтому выбор в пользу двухфотонной микроскопии всегда зависит от конкретного образца и экспериментальной задачи.
Это возвращает нас к конфокальной микроскопии и её пинхолу как, пожалуй, к самому универсальному методу оптического секционирования. Однако и он далёк от совершенства. Лазерное освещение сосредоточено в фокальной плоскости лишь почти полностью, но не абсолютно. В конце концов, лазерный пучок должен сначала дойти до фокуса, и по пути (а также после фокуса) существует ненулевая вероятность возбуждения флуорофоров, которые затем дают вклад в фоновый сигнал изображения. В тонких образцах, таких как окрашенные мембраны, это не является серьёзной проблемой, но в толстых образцах, например, в глубинных слоях ткани, простого ослабления сигнала недостаточно, особенно когда во внефокусных областях присутствуют десятки тысяч молекул. Кроме того, часть фоновой флуоресценции неизбежно проходит через пинхол и достигает детектора.
Можно ли сделать лучше? Да, можно!
Детекторы MATRIX
Матричные детекторы, такие как MATRIX, состоят из более чем 20 отдельных детекторных элементов, расположенных рядом друг с другом. Они «смотрят» на образец под разными углами и тем самым регистрируют фокусированный и внефокусный свет раздельно. Благодаря этому вклад фонового сигнала может быть измерен для каждого пикселя изображения и вычтен из общего сигнала (рис. 2). Результат — значительно улучшенное оптическое секционирование.
Рис. 2. Оптическое секционирование, реализуемое за счёт фокусировки лазерного пучка и пинхола, не является идеальным, и часть рассеянного света всегда достигает детектора. Матричный детектор, такой как MATRIX, состоит из множества отдельных элементов, которые «видят» образец под немного разными углами. Это позволяет различать свет, исходящий непосредственно из фокальной плоскости, и свет из дефокусированных областей, обеспечивая более эффективное удаление фона.
Переход от конфокальной микроскопии к MATRIX по своему значению сопоставим с переходом от широкопольной микроскопии к конфокальной. Напомним: в широкопольном микроскопе оптическое секционирование отсутствует вовсе, поэтому все молекулы светятся с одинаковой яркостью независимо от расстояния до фокуса. В конфокальном микроскопе сигнал уменьшается пропорционально квадрату расстояния до фокальной плоскости. С матричным детектором MATRIX это ослабление происходит уже по четвёртой степени расстояния. Структуры, находящиеся в 10 раз дальше от фокуса, становятся не в 100 раз, а в целых 10 000 раз более тусклыми.
Оптическое секционирование становится возможным благодаря совместной работе лазерного пучка и пинхола. Но только матричная регистрация сигнала позволяет довести его практически до совершенства.
