Арт. Celloger Pro
Введение
Адипоциты служат важнейшими резервуарами энергии, эффективно преобразуя избыток калорий в жир для будущих энергетических потребностей. Однако чрезмерное накопление жира может привести к ожирению - состоянию, связанному с различными проблемами со здоровьем в нашем современном обществе [Lennarz, William J., and M. Daniel Lane , 2013]. Помимо роли в метаболизме, адипоциты также влияют на иммунные реакции и репродуктивные функции [Britannica, The Editors of Encyclopaedia. 2023] через утилизацию гормонов, таких как лептин и адипонектин.
Процесс адипогенеза, в ходе которого преадипоциты дифференцируются в зрелые адипоциты, у разных видов протекает по-разному. Кроме того, доля клеток, подвергающихся адипогенезу, различается в тканях in vivo и в культурах клеток in vitro [Poulos, Sylvia P., Michael V. Dodson, and Gary J. Hausman, 2010]. Исследователи активно изучают факторы, участвующие в адипогенезе, и сложные регуляторные механизмы, лежащие в основе этого сложного процесса.
В обзоре, проведенном Сильвией П. Поулос, отмечается, что коэффициент дифференцировки клеток варьирует в зависимости от компонентов культуральной среды. Кроме того, уровни экспрессии факторов транскрипции, связанных с адипогенезом, меняются с течением времени, как во время посева, так и в постконфлюэнсный период. Поэтому оценка степени адипогенеза в разные моменты времени имеет решающее значение. Использование автоматизированного оборудования для визуализации живых клеток, такого как микроскоп Celloger® Pro, делает мониторинг и измерение адипогенеза удобным. В этой статье представлены методы оценки адипогенеза в процессе дифференцировки на примере широко изученной клеточной линии преадипоцитов 3T3-L1.
Материалы и методы
Содержание клеток и проверка их конфлюэнтности
Клетки 3T3-L1 культивировали в DMEM (модифицированная орлиная среда Дульбекко с высоким содержанием глюкозы, Welgene, LM001-10), дополненной 10% BCS (бычья сыворотка, Gibco, 26170043) и 1% P/S (пенициллин-стрептомицин, Gibco, 15140122). Когда клетки достигали 80-90% конфлюэнтности, их субкультивировали. Чтобы вызвать дифференцировку, клетки высевали в 12-луночный планшет в концентрациях 1X104 клеток/см2, 5X103 клеток/см2, 2,5X103 клеток/см2 и 1,25X103 клеток/см2. После посева культуральную среду меняли на второй день, а на следующий день измеряли плотность клеток с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 4X.
Индукция адипогенеза с использованием дифференцировочной среды (ДС) и наблюдение за морфологией клеток в процессе адипогенеза
На второй день после достижения конфлюэнтности ввели DM I, состоящую из DMEM, дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка, Welgene, S001-01), 1% P/S, 1 мкг/мл инсулина (раствор инсулина человека, Sigma, I9278-5ML), 0.25 мкМ дексаметазона (Sigma, D2915-100MG) и 0.5 мМ IBMX (3-изобутил-1-метилксантин, Sigma, I5879-100MG). После еще двух дней культивирования перешли на среду DM II, состоящую из DMEM, дополненной 10% FBS, 1% P/S и 1 мкг/мл инсулина. Чтобы оценить влияние росиглитазона на адипогенез, исследователи добавили 2 мкМ росиглитазона (Sigma, R2408-10MG) как в DM I, так и в DM II. На протяжении всего периода дифференцировки изображения клеток получали с интервалом в один час с помощью микроскопа Celloger® Pro, оснащенного объективами 4X или 10X.
Количественное определение липидных капель с помощью флуоресценции
В процессе дифференцировки клетки культивировали с 1 мкМ LipiDye II (FDV-0027, Funakoshi) для флуоресцентного наблюдения за липидными каплями. Охват (%) зеленой флуоресценции измеряли с помощью программы анализа Celloger для расчета площади липидных капель. Для повышения точности оценки неравномерности адипогенеза в каждой лунке были получены изображения пяти случайно выбранных точек, и было рассчитано среднее значение.
Результат
Наблюдение за морфологическими изменениями во время дифференцировки
Самым значительным структурным изменением в процессе дифференцировки адипоцитов является образование липидных капель. Это органеллы, покрытые монослоем фосфолипидов, содержащих триглицериды и эфиры стеролов. Адипоциты делятся на коричневые, бежевые и белые клетки, каждая из которых обладает уникальными характеристиками. В отличие от бежевых и коричневых клеток, которые обычно содержат несколько липидных капель на клетку, белые клетки характеризуются одной большой липидной каплей, занимающей значительную часть цитоплазмы, что делает их легко отличимыми от других типов клеток (рис. 1).
Эти три типа адипоцитов имеют разные функции. Белая жировая ткань (БЖТ), преобладающая при ожирении, в основном служит местом накопления энергии, в то время как бурая жировая ткань (БАТ) способствует расходу энергии посредством термогенеза. Недавние исследования показали, что батокины - факторы, выделяемые БАТ, - могут воздействовать на различные органы [Yang, Felix T., 2022], тем самым влияя на общий метаболизм [Yang, Felix T., 2022; Ahmad, Bilal, et al. " 2021]. Кроме того, бежевые жировые клетки, расположенные в составе БАТ, обладают свойствами, сходными с БАТ, включая термогенные способности. Более того, эти клетки могут подвергаться трансдифференцировке из зрелой ВАТ6, что привлекло к ним пристальное внимание многих исследователей.
Рисунок 1. Три типа адипоцитов
Исследователи индуцировали адипогенез в клетках 3T3-L1 и наблюдали за изменениями морфологии клеток с интервалом в один час на протяжении всего процесса с помощью микроскопа Celloger® Pro. На рисунке 2 показан процесс дифференцировки клеток 3T3-L1 с течением времени. Хотя время образования липидных капель варьировалось в зависимости от пассирования клеток, в большинстве случаев оно наблюдалось сразу же после введения DM II, содержащего росиглитазон. Клетки преимущественно превращались в коричневые жироподобные клетки с многочисленными крошечными липидными капельками. Используя микроскоп Celloger® Pro с 10-кратным объективом, исследователи могли отчетливо идентифицировать липидные капли диаметром более 3 мкм как прозрачные фигуры в форме капель воды, что избавляло от необходимости дальнейшего окрашивания.
Рисунок 2. Временная последовательность адипоцитов во время дифференцировки
В этой последовательности представлены изображения, полученные с интервалом в один час с 1 часа до 36 часов после обработки DM II и росиглитазоном (при 10-кратном увеличении, обрезанные изображения).
Количественное определение липидных капель в режиме реального времени
Многие исследователи используют реагент Oil Red O для оценки уровня дифференцировки путем определения количества липидных капель. Oil Red O - краситель, обычно используемый для окрашивания богатых липидами структур, таких как липидные капли, что позволяет визуализировать их под микроскопом. Однако окрашивание невозможно в физиологических условиях, что затрудняет отслеживание изменений во времени. Поэтому в описанных исследованиях выбрали LipiDyeII, флуоресцентный краситель, подходящий для живых клеток. LipiDyeII не только окрашивает липидные капли, но и позволяет проводить анализ в живых клетках, что делает процесс простым. Клетки в DM, содержащем LipiDyeII, демонстрировали постепенное проявление липидных капель, характеризующееся зеленой флуоресценцией. Флуоресцентные сигналы точно совпадают с оболочечными структурами, наблюдаемыми на ярко-полевом изображении (рис. 3). Даже если липидные капли скрыты внутри клеточных структур (показано стрелками на рисунке 3) или слишком малы для того, чтобы различить их в светлом поле (показано пунктирным кругом на рисунке 3), их можно легко идентифицировать с помощью флуоресценции.
Рисунок 3. Наблюдение адипоцита с липидной каплей в светлом поле и поле флуоресценции
Изображения были получены через 24 часа после замены DM II, содержащего росиглитазон, и обработки LipiDyeII с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 10X.
Исследователи количественно оценили коэффициент дифференцировки, измерив покрытие флуоресценции, которое показывает долю, занимаемую липидными каплями (рис. 4). Поскольку дифференцировка происходит не равномерно по всей пластине, а в виде пятен, для всестороннего анализа необходимо исследовать обширную область. Однако использование малых увеличений, таких как 2X, недостаточно для точного измерения маленьких липидных капель. Поэтому, используя 4-кратное увеличение и функцию многопозиционной визуализации для сканирования нескольких точек, исследователи смогли измерить долю липидных капель в более широком диапазоне и получить более надежные данные.
Рисунок 4. Измерение площади липидных капель с помощью программного обеспечения для анализа Celloger
Изображение было получено с помощью микроскопа Celloger® Pro с объективом 4X на второй день после обработки DM II и LipiDyeII. Площадь флуоресценции определялась с помощью *адаптивного порогового метода и рассчитывалась в программе анализа Celloger.
*Адаптивный пороговый метод - метод обработки изображений, при котором для разных областей изображения рассчитываются различные пороговые значения на основе локального значения пикселя, что позволяет эффективно сегментировать изображения с неравномерной освещенностью или контрастностью.
Оценка уровня дифференцировки по плотности клеток
Процесс дифференцировки адипоцитов в значительной степени регулируется и зависит от множества факторов, включая среду, в которой находятся преадипоциты, и фармакологических вмешательств [Benchamana, Ameena, et al. 2019; Pu, Yong, and Almudena Veiga-Lopez. 2017; Teixeira, Catarina, et al. 2022]. Среди них конфлюэнция клеток на момент индукции дифференцировки признана важнейшим параметром, влияющим на эффективность и качество формирования адипоцитов [Cornelius, Peter, 1994]. Кроме того, было доказано, что фармакологические агенты, такие как росиглитазон, мощный агонист пероксисомного пролифератора-активируемого рецептора гамма (PPARγ), играют важную роль в модуляции адипогенеза [Farmer, S. R. 2005; Wabitsch, Martin, et al. 2001; Tontonoz, Peter, et al. 1997; Zebisch, Katja, et al. 2012; Zhao, Xueyan, et al. 2019]. PPARγ является ключевым транскрипционным фактором, который управляет экспрессией различных генов, участвующих в созревании и функционировании адипоцитов.
Для того чтобы понять взаимодействие между конлюентностью клеток и обработкой росиглитазоном в контексте дифференцировки адипоцитов, исследователи оценивали степень дифференцировки по экспериментальной схеме, описанной на рисунке 5.
Рисунок 5. Экспериментальная схема дифференцировки 3T3-L1.
Чтобы оценить, как первоначальная плотность клеток влияет на дифференцировку адипоцитов, исследователи посеяли клетки 3T3-L1 с четырьмя различными плотностями. На третий день после посева получили изображения клеток для проверки уровня конфлюэнтности с помощью функции резервирования Celloger, которая автоматически получала изображения клеток в указанную дату (рис. 6а). Полученные изображения затем анализировались с помощью аналитического программного обеспечения Celloger для определения степени конфлюэнтности (рис. 6b). Эта первоначальная оценка была критически важна для установления исходного уровня для понимания влияния конфлюэнтности клеток на последующую дифференцировку.
Рисунок 6. Подтверждение конфлюэнтности клеток в зависимости от плотности их посева
После посева клеток мы оценивали их конфлюэнтность на третий день с помощью функции планирования таймлапса в Celloger. (a) Окно расписания таймлапсов в программе сканирования Celloger (b) Изображения, анализирующие текучесть клеток
На 6-й день, через два дня после проверки конфлюэнтности клеток, исследователи начали процесс дифференцировки адипоцитов. Чтобы определить влияние росиглитазона на этот процесс, были проведены эксперименты с двумя группами: одна обрабатывалась DM, содержащим росиглитазон, а другая - без росиглитазона (рис. 5). Исследователи оценивали уровень дифференцировки адипоцитов путем нанесения красителя LipiDyeII и последующего измерения флуоресцентного покрытия, которое указывает на площадь липидных капель. Измерение проводилось в пяти различных позициях с помощью программы анализа Celloger. На рисунке 7 представлены результаты, наблюдаемые на 13-й день (рисунок 7а) и в течение всего 5-дневного периода (с 8-го по 13-й день) (рисунок 7б) после добавления DM II с росиглитазоном или без него. Введение росиглитазона заметно повышало скорость дифференцировки адипоцитов, о чем свидетельствовало усиление флуоресценции, обозначающее повышенное накопление липидов. Клетки, выращенные в DM II без росиглитазона, показали скорость дифференцировки всего 4.7% через 120 часов. Напротив, культивирование клеток в DM II с росиглитазоном приводило к быстрому увеличению дифференцировки, достигая процента дифференцировки клеток 16.6 % через 97 часов. Однако различия в степени дифференцировки в зависимости от концентрации клеток были незначительными.
Рисунок 7. Количественная оценка площади липидных капель в зависимости от плотности клеток и приема росиглитазона
(a) Гистограмма иллюстрирует степень адипогенеза в зависимости от плотности клеток на 13-й день. Столбики ошибок представляют собой стандартную ошибку (n=5). (b) На этом графике показана прогрессия образования липидных капель с течением времени после добавления DM II (с 8-го по 13-й день). Для анализа были получены флуоресцентные изображения в пяти различных точках, стандартные ошибки показаны заштрихованными областями розового или небесно-голубого цвета (DM с росиглитазоном: n=5, DM с росиглитазоном: n=5, ростовая среда: n=1). Клетки, обработанные DM II, содержащим росиглитазон, демонстрировали значительно более быстрый рост дифференцировки по сравнению с клетками без росиглитазона, как показал двухфакторный t-тест с p-значением < 0,0001. Группа ростовой среды представляет клетки, которые не подвергались обработке DM. Чтобы не усложнять график, другие концентрации были опущены.
Заключение
Адипогенез - сложный процесс, регулируемый уровнями экспрессии различных факторов, часто контролируемых во времени или подверженных влиянию взаимодействия с другими клеточными элементами. Понимание этих сложных механизмов требует тщательного наблюдения в течение длительного времени. Традиционно исследователи оценивают уровни экспрессии определенных маркеров в определенные моменты времени в процессе дифференцировки. Однако система Celloger® Pro произвела революцию в этом подходе, обеспечив непрерывный и долгосрочный мониторинг. Благодаря функции планирования временных интервалов исследователи могут проводить длительные наблюдения без ограничений по времени, что повышает эффективность эксперимента. Примечательной особенностью микроскопов Celloger® Pro является регулируемый уровень увеличения, позволяющий наблюдать за образованием липидных капель при высоком увеличении, в то время как при более низком увеличении можно получить более широкую область изображения для оценки общей дифференцировки адипоцитов. Кроме того, флуоресцентное окрашивание липидных капель и использование аналитического программного обеспечения Celloger для измерения интенсивности флуоресценции позволяют исследователям количественно оценить степень дифференцировки, придавая числовые значения наблюдаемым изменениям. Такое сочетание функций позволяет получить бесценные сведения о динамических регуляторных механизмах, управляющих дифференцировкой адипоцитов, что углубляет наше понимание адипогенеза и его важнейшей роли в метаболическом здоровье.
