Арт. CA532
Почему специалисты по сверхразрешающей микроскопии любят альпак?
Потому что у них есть нанотела!
Это очень простой, но при этом чрезвычайно важный факт: точность локализации белков в любой системе сверхразрешающей микроскопии может быть не выше, чем позволяет размер флуоресцентной метки. Иными словами, если флуорофор слишком большой или расположен слишком далеко от белка-мишени, разрешающая способность микроскопа может быть сколь угодно высокой — неопределённость в том, где именно находится белок, всё равно останется.
Хорошая новость заключается в том, что существуют способы уменьшить расстояние между целевым белком и флуоресцентной меткой. Один из таких способов — использование нанотел.
Нанотела для сверхразрешающей микроскопии
Мы часто говорим об оптической физике, математических функциях и подобных вещах. И всё это абсолютно верно. Однако до сих пор мы не затрагивали разницу между разрешением и точностью локализации. Сверхразрешающая микроскопия обеспечивает разрешение в нанометровом диапазоне, но это разрешение относится исключительно к зарегистрированным флуоресцентным молекулам. Разрешение в 3 нм вовсе не означает, что белки, меченные флуорофорами, можно локализовать с той же точностью.
Если флуоресцентный краситель слишком велик или расположен слишком далеко от интересующего белка, точность локализации никогда не будет выше этого смещения. Однако существуют способы уменьшить расстояние между мишенью и меткой — и один из них заключается в использовании нанотел, также известных как VHH-фрагменты или однодоменные антитела.
Нанотела — это исключительно компактные и структурно простые антитела, происходящие от особого типа антител, встречающихся только у верблюдовых (camelidae), к которым относятся верблюды, ламы и альпаки.
Чтобы понять преимущества нанотел в сверхразрешающей микроскопии, сначала кратко напомним, как работает иммунофлуоресцентное окрашивание.
Приблизить метку к мишени
При иммунофлуоресцентном окрашивании биомолекула интереса — как правило, белок — метится флуорофором с помощью антител. Обычно используются антитела класса иммуноглобулинов G (IgG). Существует две стратегии мечения (рис. 1):
- Прямое иммунофлуоресцентное окрашивание — используется одно антитело, которое связывается с белком-мишенью и уже несёт флуорофор.
- Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание — применяется два антитела последовательно. Первичное антитело связывается с белком, но не содержит флуорофора; флуорофор вносится вторичным антителом, которое связывается с первичным.
Рис. 1. Прямое и непрямое иммунофлуоресцентное (IF) окрашивание с использованием антител (AB). Тёмно-серый — целевой белок, светло-серый — первичное антитело, оранжевый — флуорофор-связанное антитело.
В большинстве случаев предпочтение отдаётся непрямому иммунофлуоресцентному окрашиванию, поскольку у него есть ряд преимуществ. Одно из них — более яркий сигнал: к одному первичному антителу могут связываться несколько (чаще всего поликлональных) вторичных антител, несущих флуорофоры, что значительно повышает чувствительность [Im K, Mareninov S, Diaz MFP, 2019; Carrington G, Tomlinson D, Peckham M. 2019].
Однако у непрямого окрашивания есть и обратная сторона: образуется молекулярный комплекс первичного и вторичного антител диаметром около 30 нм. Это означает, что флуорофор может находиться примерно в 20 нм от целевого белка. Такое смещение называется ошибкой связывания (linkage error).
При конфокальной микроскопии с разрешением порядка 250 нм такая ошибка не критична. Но в сверхразрешающей микроскопии, где STED или PALM/STORM позволяют различать структуры размером 20–30 нм, а MINFLUX — даже 2–3 нм, она становится принципиально важной.
Таким образом, крупные комплексы антител приводят к значительному смещению между мишенью и меткой, ограничивая достижимую точность локализации. Кроме того, большие метки могут физически препятствовать связыванию друг друга, особенно при плотной упаковке белков — типичной для клеток и тканей. [Sograte-Idrissi S, Schlichthaerle T, 2020; Ries J, Kaplan C, Platonova E, 2012; Gomes de Castro MA, Höbartner C, Opazo F. 2017]
Нанотела в наномасштабе
К этому моменту, вероятно, уже понятно, в чём заключается преимущество нанотел. Всё отражено в их названии: по сравнению с классическими IgG-антителами длиной около 12 нм, нанотела имеют размер всего ≈ 3 нм. Это различие ещё нагляднее при сравнении молекулярной массы: IgG (~150 кДа) примерно в 10 раз тяжелее, чем нанотело (12–15 кДа).
Нанотела настолько малы потому, что по сути являются фрагментами антител верблюдовых, которые сами по себе имеют более простую структуру. Обычные антитела состоят из четырёх пептидных цепей — двух тяжёлых и двух лёгких. Антигенсвязывающий участок формируется двумя вариабельными доменами: VH (тяжёлая цепь) и VL (лёгкая цепь).
У антител верблюдовых отсутствуют лёгкие цепи, поэтому их антигенсвязывающий домен представлен единственным вариабельным доменом тяжёлой цепи — VHH. Именно из этого домена и получают нанотела (рис. 2). Фактически, нанотело — это «антитело, сведённое к минимуму».
Рис. 2. Структура и размеры обычных IgG-антител, тяжёлых цепных антител верблюдовых (например, альпака) и нанотел.
Снижение ошибки связывания
Благодаря малому размеру нанотела значительно уменьшают ошибку связывания. Один из подходов — замена флуорофор-связанных вторичных антител на поликлональные вторичные нанотела. Такие нанотела способны связываться с несколькими эпитопами первичного антитела, включая те, которые недоступны для обычных вторичных антител. В результате сохраняется высокая степень усиления сигнала, а комплекс «первичное антитело + нанотела» оказывается лишь немного больше одного антитела (рис. 3).
Рис. 3. Прямое и непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антител и нанотел.
Например, микротрубочки, окрашенные вторичными нанотелами, конъюгированными с красителем abberior STAR RED, демонстрируют существенно меньший кажущийся диаметр филаментов (67 нм) по сравнению с окрашиванием стандартными вторичными антителами (77 нм) (рис. 4).
Рисунок 4. Конфокальные и STED-изображения тубулина, полученные с использованием непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. Первичные мышиные антитела против тубулина (AB) детектировались либо вторичными антителами (слева), либо вторичными (в центре). Использование вторичных нанотел снижает ошибку связывания и, как следствие, уменьшает кажущийся диаметр тубулина на 10 нм. Масштабная линейка: 2 мкм.
Ещё большего снижения ошибки связывания можно добиться при использовании флуорофор-связанных нанотел в прямом иммунофлуоресцентное окрашивании. Однако в этом случае действуют те же ограничения, что и для прямого окрашивания обычными антителами: отсутствие усиления сигнала и ограниченный набор доступных нанотел.
Мультиплексное окрашивание: больше цветов в одном изображении
Повышение разрешения открывает новые возможности для биологических исследований. Ещё один важный параметр флуоресцентной микроскопии — количество различных белков, которые можно одновременно визуализировать в одном образце.
В классическом непрямом иммунофлуоресцентном окрашивании каждое первичное антитело должно быть получено от разного вида-хозяина, чтобы избежать перекрёстной реактивности вторичных антител. Теоретически эту проблему можно обойти, предварительно инкубируя каждое первичное антитело со «своим» вторичным. Однако при использовании обычных вторичных антител это невозможно, поскольку они бивалентны и приводят к образованию крупных агрегатов.
Нанотела решают и эту проблему. Они моновалентны, то есть связываются только с одной мишенью, поэтому их можно безопасно предварительно смешивать с первичными антителами (рис. 5). В результате агрегаты не образуются, и становится возможным мультиплексное окрашивание.
Рис. 5. Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием вторичных нанотел по протоколу premix & stain.
С использованием вторичных нанотел можно применять несколько первичных антител, полученных от одного и того же вида, и получать многоцветные изображения. Пример трёхцветного STED-изображения приведён на рис. 6.
Рисунок 6. Трёхцветное STED-изображение, полученное с использованием непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания с предварительно смешанными комплексами первичных антител, полученных у мыши, и вторичных нанотел, конъюгированных с флуорофорами. Окрашенные структуры: вименти́н (зелёный), тубулин (пурпурный) и двуцепочечная ДНК (синий).
Заключение
Нанотела быстро стали универсальным инструментом молекулярной биологии. В области флуоресцентной микроскопии они уже решают сразу несколько ключевых задач — снижение ошибки связывания, улучшение разрешения и возможность мультиплексного окрашивания. И, без сомнения, это только начало.
