Арт. FL565
Крупные клеточные структуры могут в достаточной степени изменять проходящий через них свет, чтобы быть непосредственно видимыми в световой микроскоп. Для визуализации более мелких структур световая микроскопия опирается на специфическое мечение флуоресцентными красителями. Краситель позволяет косвенно визуализировать целевые молекулы, регистрируя их флуоресцентное излучение.
Точный и мощный инструмент
Разумеется, обычные клетки или тканевые образцы изначально не содержат флуорофоров, поэтому перед получением изображений их необходимо ввести в образец. Существуют различные стратегии доставки красителя в исследуемый материал, например, коэкспрессия флуоресцентного белка или клик-химия. Однако наиболее универсальным и потому самым распространённым подходом является иммунофлуоресценция.
Если вы когда-либо хотели разобраться, как работает иммунофлуоресценция и какие свойства антител делают её столь мощным инструментом, одновременно определяя её ограничения, — читайте дальше.
При иммунофлуоресцентном мечении флуорофор доставляется к интересующей биомолекуле, чаще всего к белку, с помощью антител. Поскольку антитела играют здесь центральную роль, имеет смысл подробнее рассмотреть их устройство, прежде чем переходить к техническим аспектам иммунофлуоресценции.
Антитела, или иммуноглобулины, являются неотъемлемой частью иммунной системы. Они вырабатываются специализированными иммунными клетками — B-клетками — при встрече с чужеродной молекулой, например, компонентом вируса или бактерии. Антитела помогают иммунной системе распознать и нейтрализовать эту молекулу и связанный с ней патоген. Два свойства делают антитела идеально подходящими для этой задачи: специфичность и аффинность. Это означает, что они исключительно хорошо находят именно «свою» молекулу и, связавшись с ней, практически не отсоединяются. По этим причинам антитела незаменимы не только для иммунной защиты организма, но и в биологических исследованиях — для обнаружения, маркировки или изоляции интересующих белков.
Большинство людей легко узнают изображение антитела, поскольку оно очень характерно: антитела представляют собой Y-образные белки, состоящие из четырёх цепей — двух так называемых тяжёлых и двух лёгких (рис. 1). «Ствол» и часть «рукавов» антитела одинаковы для всех антител одного класса (например, иммуноглобулина G (IgG), наиболее распространённого типа) и вместе называются константной областью. Внешняя часть «рукавов», напротив, различается от антитела к антителу и называется вариабельной областью. Вариабельная область тяжёлой цепи (VH) и вариабельная область лёгкой цепи (VL) вместе образуют антиген-связывающий домен. Именно эта часть антитела распознаёт и связывает целевую структуру — эпитоп, определяя специфичность антитела [Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. 2005]
Рис. 1. Структура антитела IgG (AB). Антитело состоит из четырёх цепей — двух тяжёлых и двух лёгких. Участки цепей на концах «рукавов» различаются у разных антител и являются вариабельными. Вариабельные области тяжёлой (VH) и лёгкой (VL) цепей формируют антиген-связывающий домен, определяющий, какой эпитоп распознаёт и связывает антитело. Остальная часть антитела одинакова для всех IgG и называется константной областью.
Для научных целей антитела получают у животных — чаще всего у мышей, крыс, кроликов, а также у более крупных животных, таких как ослы и козы. В норме B-клетки животного реагируют на чужеродную молекулу массовым синтезом антител для её маркировки. Эту иммунную реакцию можно «использовать в своих целях», просто введя животному белок интереса — в ответ его B-клетки начнут активно вырабатывать антитела, специфичные к этому белку. Именно то, что нужно исследователю.
Важным параметром антител, используемых в иммунофлуоресценции, является их клональность: они могут быть моноклональными или поликлональными (рис. 2). Антитела, продуцируемые одной B-клеткой, абсолютно идентичны — они относятся к одному типу (например, IgG) и распознают один и тот же эпитоп.
Если антитела получены из клонов одной B-клетки, они называются моноклональными: все они распознают один и тот же эпитоп. Это можно сравнить с несколькими абсолютно одинаковыми ключами от одного здания, которые открывают один и тот же замок. Другой вариант — антитела, которые распознают один и тот же белок, но разные его эпитопы, поскольку они происходят от разных B-клеток. Такие антитела называются поликлональными. Это похоже на набор ключей от одного здания (тот же «белок»), но каждый ключ открывает свою дверь с собственным замком.
Если известно, что у человека есть «моноклональный» ключ, можно точно сказать, через какую дверь он вошёл — ключ подойдёт только к одному замку. Аналогично, моноклональные антитела обладают высокой специфичностью и очень низкой перекрёстной реактивностью, то есть они почти не связываются с чем-либо, кроме своего эпитопа. В иммунофлуоресценции это приводит к низкому уровню фонового сигнала. Однако интенсивность сигнала у них ниже, поскольку к каждой молекуле-мишени может связаться только одно антитело. Кроме того, моноклональные антитела дороже в производстве. Наконец, поскольку все они идентичны, модификация антитела флуорофором может повлиять на его связывание сразу у всей партии, снижая функциональность.
Поликлональные антитела, напротив, обеспечивают большую гибкость — но при меньшей определённости. Они относительно недороги, дают более высокий сигнал, так как могут связываться с несколькими эпитопами одного белка, а присоединение флуорофора вряд ли повлияет на связывание всех антител сразу. Однако их свойства и качество могут варьировать от партии к партии, и они чаще демонстрируют перекрёстную реактивность, связываясь с другими белками и увеличивая фоновый сигнал. [Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. 2005]
Рис. 2. Различия между моноклональными и поликлональными антителами (AB). Моноклональные антитела получены из клонов одной B-клетки, полностью идентичны и распознают один и тот же эпитоп. Благодаря высокой специфичности они характеризуются низкой перекрёстной реактивностью, но меньшей чувствительностью, поскольку каждый целевой белок связывается только с одним антителом. Поликлональные антитела происходят от пула B-клеток и распознают несколько эпитопов одного белка, что повышает чувствительность, но увеличивает риск связывания с другими белками.
Два шага — для более сильного сигнала
Имея это в виду, вернёмся к иммунофлуоресцентному окрашиванию. Существуют две основные стратегии мечения (рис. 3):
- Прямая иммунофлуоресценция — используется одно антитело, которое связывается с белком-мишенью и уже несёт флуорофор.
- Непрямая иммунофлуоресценция — применяется последовательное использование двух антител. Первичное антитело связывается с белком-мишенью, но не содержит флуорофора. Флуорофор доставляется вторичным антителом, которое распознаёт константную область первичного антитела.
Первичные антитела обычно получают у мышей или кроликов. Вторичные антитела, как правило, вырабатываются у ослов, коз или кроликов путём иммунизации антителами мыши или кролика.
Рис. 3. Прямое и непрямое иммунофлуоресцентное (IF) окрашивание. Тёмно-серый — целевой белок, светло-серый — первичное антитело (AB), оранжевый — антитело, конъюгированное с флуорофором.
На первый взгляд прямая иммунофлуоресценция выглядит более привлекательной, поскольку протокол проще и быстрее. Почему же она используется реже? Есть два основных недостатка. Во-первых, количество коммерчески доступных первичных антител, уже конъюгированных с флуорофором, ограничено: для каждого белка необходимо индивидуально получить антитело и связать его с красителем. Велика вероятность, что подходящего антитела к вашему белку просто не существует. Во-вторых, при прямом мечении каждая молекула-мишень связывается максимум с одним флуорофор-содержащим антителом, что приводит к относительно слабому сигналу.
По этим причинам в большинстве случаев выбирают непрямую иммунофлуоресценцию. Здесь к одному первичному антителу могут связываться два моноклональных или даже больше поликлональных вторичных антител, несущих флуорофоры, что значительно усиливает сигнал и повышает чувствительность [Im K, Mareninov S, Diaz MFP, Yong WH. 2019;Carrington G, Tomlinson D, Peckham M. 2019]. Таким образом, первичное антитело обеспечивает высокоспецифичное распознавание мишени, а вторичное выполняет универсальную функцию флуоресцентного маркирования.
Зная ограничения
Непрямая иммунофлуоресценция предоставляет исследователям чрезвычайно универсальный инструмент для высокоспецифичного и чувствительного мечения белков. Главное её преимущество — возможность нацеливания практически на любой белок, при условии наличия соответствующего антитела.
Однако, как и у любого метода, у иммунофлуоресценции есть свои ограничения. Во-первых, число различных белков, которые можно одновременно окрасить в одном образце, ограничено. Для каждого первичного антитела требуется свой вид животного-продуцента. Поскольку первичные антитела чаще всего получают у мышей и кроликов, обычно невозможно окрасить более двух белков одновременно: вторичное антитело не сможет различить, например, два мышиных антитела, связанные с разными белками, и вы не сможете промаркировать их разными флуорофорами.
Во-вторых, размер комплекса первичного и вторичного антител — порядка 30 нм — может стать проблемой. В плотно упакованной клеточной среде такие комплексы могут экранировать друг друга и препятствовать доступу к эпитопам. Кроме того, из-за своих размеров флуорофор может быть смещён относительно целевого белка примерно на 20 нм. Пока разрешение световой микроскопии ограничивалось пределом Аббе (~250 нм), эта так называемая ошибка связывания была несущественной. Однако с появлением методов сверхразрешающей микроскопии смещение в 20 нм приводит к размыванию изображений, которые в противном случае могли бы быть исключительно чёткими.
К счастью, существует новый тип антител, который позволяет решить обе эти проблемы.
