SIM vs STED микроскопия: ограничение частот

Микроскопия со структурированным освещением (SIM) использует частотные паттерны, возникающие при освещении образца с решёткой света, чтобы разрешать детали, невидимые в широкопольном микроскопе. Однако количество извлекаемой таким образом информации ограничено, а сам метод в значительной степени опирается на постобработку для реконструкции изображения. В результате SIM не дотягивает до настоящих суперразрешающих технологий, таких как STED. С точки зрения разрешения SIM и конфокальная микроскопия имеют примерно одинаковые фундаментальные ограничения. Ниже разберёмся, почему.

В 2001 году Матс Густафссон опубликовал небольшую статью в Journal of Microscopy [Gustafsson, M.G.L. 2001]. В ней он указал, что улучшение разрешения конфокальной флуоресцентной микроскопии по сравнению с широкопольной микроскопией ограничено. Он объяснил, что «конфокальный микроскоп регистрирует расширенную информацию о разрешении лишь слабо и только при работе с пинхолом, значительно меньшим, чем диск Эйри. Такой малый пинхол отсекает значительную часть полезного сигнала от флуоресценции в фокусе вместе с нежелательным сигналом из внефокальных областей».

В качестве альтернативы Густафссон предложил метод, при котором образец освещается тонкими световыми полосами. Это приводит к формированию паттернов, содержащих информацию о высоком пространственном разрешении, которую можно извлечь вычислительным путём. Он назвал этот метод микроскопией со структурированным освещением (structured illumination microscopy, SIM).

С тех пор SIM стала широко распространённым инструментом флуоресцентной визуализации. SIM — быстрый метод, поскольку не требует сканирования, совместим с обычными флуоресцентными метками и надёжно даёт визуально качественные изображения благодаря встроенной обработке данных (однако стоит помнить: не всё, что выглядит хорошо, действительно корректно — к этому мы ещё вернёмся). Тем не менее, разрешение SIM ограничено примерно так же, как и в конфокальной микроскопии, пусть и при более высоком уровне сигнала.

Как правило, коммерческие SIM-системы обеспечивают улучшение разрешения по сравнению с широкопольной микроскопией примерно в 2 раза — до ~100 нм в латеральном направлении и ~350–400 нм по оси Z. Таким образом, когда речь идёт о получении чётких изображений с разрешением в десятки или даже единицы нанометров, суперразрешающие методы, такие как STED, значительно превосходят возможности SIM (см. сравнительную таблицу ниже).

Чтобы понять природу этого ограничения, нам придётся ненадолго погрузиться в мир частот.

Из реального пространства в пространство частот

Любой визуальный стимул — сигнал, изображение — может быть представлен как сумма множества синусоидальных волн с разными частотами и амплитудами. Высокие частоты, как правило, соответствуют мелким деталям, тогда как низкие частоты описывают более грубую структуру изображения. Преобразование Фурье разлагает этот суммарный сигнал на отдельные синусоидальные компоненты, переводя информацию из пространственной области в частотную.

Рис. 1. Составляющие синусоидальные частоты визуального сигнала могут быть извлечены с помощью преобразования Фурье. Ограничение полосы пропускания не позволяет высоким пространственным частотам пройти через систему, что и ограничивает разрешение.

Дифракционный предел, ограничивающий разрешение классических оптических систем в реальном пространстве, в частотном представлении соответствует пределу полосы пропускания, который не пропускает высокие пространственные частоты через оптическую систему.

Примечание: здесь речь идёт именно о пространственных частотах — количестве циклов изменения сигнала при перемещении в пространстве, например, вдоль одной из координат образца. Существуют также временные частоты, описывающие изменения во времени, но в контексте SIM нас интересуют исключительно пространственные частоты.

В эпифлуоресцентном широкопольном микроскопе высокочастотные компоненты сигнала флуоресценции отсекаются и не регистрируются. Без высоких частот теряется информация о мелких деталях, и разрешение остаётся низким. Один из способов повысить разрешение — манипулировать высокими частотами так, чтобы «сдвинуть» их в предел полосы пропускания системы.

Из школьного курса физики можно вспомнить, что при перемножении двух сигналов с разными частотами возникают новые частоты, равные сумме и разности исходных. Именно это и используется в SIM.

Возбуждение на одной частоте

В SIM флуорофоры в образце возбуждаются полосатым синусоидальным паттерном с известной пространственной частотой. Предположим, что эта частота находится на границе полосы пропускания микроскопа. Распределение возбуждённых флуорофоров в образце при этом представляет собой произведение частоты возбуждения и неизвестных частот, описывающих структуру образца. Это означает, что происходит частотное смешение: в сигнале появляются компоненты, соответствующие разности частот возбуждения и частот образца, помимо исходных частот.

Разностная частота будет малой для тех частот образца, которые лишь немного выше (или ниже) частоты возбуждения — аналогично тому, как разность двух близких чисел мала. А низкие частоты могут быть зарегистрированы системой, поскольку они лежат внутри дифракционно ограниченной полосы пропускания.

Таким образом, становится возможным детектировать частоты, немного превышающие частоту возбуждения, установленную на границе полосы пропускания — частоты, которые в обычных условиях были бы заблокированы. В результате сигнал флуоресценции содержит расширенную информацию о разрешении.

Однако эта информация не может быть напрямую использована для формирования изображения, поскольку «сдвинутые вниз» частоты накладываются на низкочастотные компоненты, которые по-прежнему присутствуют в сигнале. Кроме того, освещение полосами с одной частотой не возбуждает флуорофоры во всех пространственных положениях, и частотное смешение происходит только вдоль одного направления.

Поэтому выполняется серия измерений с разными фазами и ориентациями решётки освещения, а затем данные обрабатываются вычислительно для реконструкции изображения образца.

Возбуждение и регистрация сигнала в точке

По сути, конфокальная микроскопия делает то же самое, что и SIM. Ключевое различие состоит в том, что в конфокальной микроскопии используется не одна частота освещения полосой, как в SIM, а целый непрерывный спектр пространственных частот.

Освещающая точка конфокального микроскопа содержит набор низких и высоких частот вплоть до предела полосы пропускания, сумма которых формирует диск Эйри. В результате сигнал флуоресценции также включает исходные и «смешанные» частоты образца. Часть высоких частот снова сдвигается в предел полосы пропускания системы, и регистрируемый сигнал содержит больше деталей, чем в широкопольной микроскопии, где частота возбуждения фактически равна нулю и никакого смешения не происходит.

В конфокальной микроскопии возбуждение локализовано в одной точке, а не распределено по всему полю зрения в виде полос, как в SIM. Поэтому здесь можно обойтись без вычислительной реконструкции: «сырые» данные и есть изображение, пусть и состоящее из одной маленькой, но детализированной точки.

Конфокальные микроскопы формируют изображение путём сканирования поля зрения — по одной или нескольким точкам одновременно (в зависимости от типа системы). Важно понимать, что и SIM, и конфокальная микроскопия остаются дифракционно ограниченными, а их разрешение — конечным. Исключением является нелинейная SIM, использующая высокие мощности для насыщения возбуждения и генерации ещё более высоких частот за пределами полосы пропускания. Однако нелинейная SIM не получила широкого распространения из-за сильного фотообесцвечивания образцов.

Зависимость от длины волны

Современные SIM-системы позволяют проводить длительные эксперименты (>1 часа) и, благодаря параллельной регистрации, обеспечивают скорости более 500 кадров в секунду при большом поле зрения (>200 мкм). Они подходят для визуализации образцов толщиной в несколько клеточных слоёв и стандартно поддерживают 4–6 флуоресцентных каналов. SIM-изображения часто выглядят лучше, чем конфокальные. Во-первых, уменьшение диаметра пинхола в конфокальной микроскопии для повышения разрешения приводит к потере сигнала. Во-вторых, обязательная постобработка данных в SIM обычно включает этапы сглаживания.

Однако эти преимущества сопровождаются рядом существенных ограничений. Точность SIM зависит от точного знания формы возбуждающего светового паттерна. Оптика и сам образец могут искажать полосы освещения, что приводит к артефактам при реконструкции изображения — особенно при работе с толстыми образцами или при несоответствии показателей преломления. Хотя такие артефакты хорошо описаны, они не всегда очевидны, поскольку алгоритмы постобработки всё равно формируют изображение на основе искажённых данных.

Поэтому для получения достоверных SIM-изображений требуется тщательная юстировка и калибровка микроскопа, внимание к различиям показателей преломления образца и иммерсионной среды, а также понимание влияния характеристик освещения и функции рассеяния точки (PSF) на итоговую реконструкцию.

Как это выглядит в сравнении с суперразрешающей микроскопией на основе стимулированного испускания (STED)? Хотя SIM и STED имеют некоторые общие сильные стороны, описанные выше недостатки SIM для STED нехарактерны. STED — это физически реализованное суперразрешение, при котором «сырые» данные уже являются финальным изображением и не оставляют пространства для неоднозначной интерпретации (подробнее — в материале о принципе работы STED). Более того, современные STED-системы представляют собой готовые «plug-and-play» решения, позволяющие получать суперразрешающие изображения практически сразу и с минимальным обучением.

Сравнение SIM и STED

Параметр	SIM	STED
Латеральное разрешение	60–100 нм	~20 нм
Аксиальное разрешение	200–300 нм	~75 нм
Скорость при малом поле зрения	+	+++
Скорость при большом поле зрения	+++	+
Постобработка	Требуется для реконструкции	Опциональна
Совместимость с живыми клетками	Да	Да
Многоканальная визуализация	+++	++
3D визуализация живых клеток	Только для тонких образцов	Да
Потенциальные артефакты	- Трудно выявляемы из-за постобработки; - локальные несоответствия показателя преломления; вклад внефокального сигнала; - искажения формы освещения	Проблемы формирования изображения легко обнаружимы

Самое важное различие между STED и SIM заключается в том, что структурированное освещение остаётся зависимым от длины волны. Это ограничение невозможно преодолеть в нанометровом масштабе. Лишь методы, действительно обходящие дифракционный предел, позволяют заглянуть глубже и увидеть молекулярные детали природы с большей ясностью. Так что, возможно, пришло время двигаться дальше