Арт. Mizar TILT
Задача исследования
Получение изображений живых образцов в течение продолжительного периода времени является сложной задачей из-за повышенного риска фототоксичности исследуемого образца, а также обесцвечивания флуоресцентных репортеров. В обычной эпифлуоресцентной микроскопии, когда свет возбуждения проходит через весь образец, эти риски увеличиваются. Кроме того, визуализация интересующих элементов образца в фокальной плоскости объектива может быть затруднена из-за возбуждения флуорофоров над и под ней, этот процесс известен как процесс «вне фокусной» флуоресценции.
|
Группа доктора Кикуё Тачибана заинтересована в дальнейшем понимании как ооцит превращается в зиготу после оплодотворения. Понимание происходящих механизмов внутри зиготы, которые устанавливают тотипотентность (способность клетки путём деления дать начало любому клеточному типу организма), представляет большой интерес для этой группы ученых, как и архитектура хроматина. Чтобы получить представление о происходящих в клетке процессах, группа опирается на использование нескольких передовых методов визуализации, в том числе конфокальную микроскопию. Ооциты и зиготы трудно визуализировать в течение длительного периода времени, потому что они чрезвычайно светочувствительны - слишком много света возбуждения останавливает развитие. |
|
Решение от Cairn Research
Система плоскостного освещения TILT создает тонкий слой света возбуждения, гарантируя, что только «срез» образца будет освещен в любой момент времени. Флуорофоры выше и ниже фокальной плоскости объектива больше не возбуждаются, что сводит к минимуму расфокусированную флуоресценцию и снижает фототоксичность и фотообесцвечивание, помогая обеспечить возможность визуализации живых образцов в течение более длительного времени. Изобретенный доктором Полом Мэддоксом и Таннером Фадеро (Университет Северной Каролины, США) и спроектированный и произведенный компанией Cairn Research от их имени, модуль плоскостного освещения Tilt может быть соединен с целым рядом коммерчески доступных инвертированных микроскопов. Он уникален тем, что его можно использовать с очень широким выбором объективов, в том числе с масляным иммерсионным объективом с большой числовой апертурой (NA). Обе эти особенности были важны для группы доктора Тачибана, потому что они хотели модернизировать существующий микроскоп Zeiss Axiovert 200M, в то же время используя несколько иммерсионных объективов установленных на данном микроскопе. Очень часто желательно использовать объектив с большой числовой апертурой NA, в применениях где это возможно, чтобы максимизировать захват испускаемой флуоресценции и обеспечить улучшенное пространственное разрешение по сравнению с объективом с более низкой числовой апертурой. Еще одна полезная конструктивная особенность модуля плоскостного освещения TILT заключается в том, что исследуемые с помощью микроскопа ооциты могут также отображаться с использованием проходящего освещения, что позволяет конечному пользователю получать простые изображения в светлом поле (или с дифференциальным интерференционным контрастом и фазовым контрастом), а также флуоресцентные изображения во время серии многоканальных съемок исследуемого объекта.
Модуль плоскостного освещения TILT заменяет установленный на микроскопе моторизованный столик и может быть легко прикреплен к большинству имеющихся в продаже инвертированных микроскопов. В данном исследовании модуль плоскостного освещения был прикреплен к микроскопу Zeiss Axiovert 200M. Модуль TILT представляет собой оптико-механическую сборку, которая создает плоский лист света с помощью цилиндрической линзы и фотошаблона, и позволяет точно позиционировать его внутри рабочего расстояния широкого ассортимента объективов. Модуль TILT также содержит встроенный моторизованный столик с перемещением по оси x, y, а также пьезоэлектрическое устройство для перемещения по оси z. Камера sCMOS Prime BSI (Teledyne Photometrics), настольный инкубатор UNO (Okolab), многоволновый лазер C-Flex (Cobolt) с лазерными головками 488 нм (100 мВт) и 561 нм (100 мВт) также были установлены при модернизации существующего микроскопа. Система визуализации была сконфигурирована компанией Cairn Research для управления с помощью программного обеспечения MicroManager. Поскольку многоволновый лазер C-Flex не имеет специальных драйверов для MicroManager, компания Cairn Research предоставила интерфейсное решение для управления включением/выключением затвора и интенсивностью каждого лазера из программного обеспечения.
Выводы
Основываясь на оценке потребностей группы доктора Тачибана, существующий каркас микроскопа был модернизирован, добавив возможность визуализации на световом листе, позволяя конечному пользователю отслеживать динамические процессы внутри эмбриона яйцеклетки или ранней стадии развития с улучшенным пространственно-временным разрешением. В результате добавления модуля плоскостного освещения TILT эти процессы могут отображаться с большей частотой кадров, в то же время сводя к минимуму пагубное влияние на жизнеспособность исследуемых образцов.
Комментарии доктора Кикуё Тачибана - «Благодаря системе TILT мы наконец-то можем проследить за чувствительными процессами эмбриогенеза млекопитающих с беспрецедентным пространственно-временным разрешением».
