Арт. ct-dSPIM
Что такое SPIM или LSFM?
Селективная микроскопия плоскостного освещения (Selective Plane Illumination Microscopy - SPIM) - это быстрая и щадящая техника визуализации исследуемого образца в микроскопии, которая сочетает в себе скорость широкопольной микроскопии с умеренным оптическим сечением и низким фотообесцвечиванием. Она стала важным методом флуоресцентной визуализации в микроскопии, особенно для объемной визуализации. Метод SPIM также упоминается как флуоресцентная микроскопия плоскостного освещения (Light Sheet Fluorescence Microscopy - LSFM) или просто «тонкий фронт света».
Определяющим признаком методов SPIM или LSFM является планарное освещение фокальной плоскости исследуемого образца сбоку. Только тонкий участок образца освещается в любой момент времени, сводя к минимуму фотоповреждения, а также обеспечивая оптическое сечение, которое улучшает соотношение сигнал/шум по сравнению с широкопольной эпифлуоресценцией. Поскольку изображение собирается в широком поле (двухмерная параллель), визуализация образца при использовании метода плоскостного освещения получается намного быстрее, чем в конфокальном микроскопе с точечным сканированием, который обнаруживает только один пиксель за раз.
Рис. 1. Сравнение различных методов освещения при микроскопии
Микроскопия с использованием плоскостного освещения быстро приобрела популярность для получения объемной визуализации из-за трех ключевых особенностей: во-первых, фотоповреждение сводится к минимуму, поскольку возбуждение светом ограничено вблизи фокальной плоскости, поэтому, живые образцы живут дольше. Во-вторых, достигается хорошее оптическое сечение, часто приближающееся к конфокальной микроскопии. В-третьих, скорость сбора данных очень высокая, на несколько порядков выше, чем у традиционного конфокального микроскопа.
Основным недостатком метода SPIM является то, что для создания плоскостного освещения требуется дополнительная оптика. Чаще всего дополнительный объектив освещения размещается ортогонально объективу детектирвоания, а оптика, формирующая плоскостное освещение, размещается между этим объективом освещения и лазерным источником. Добавление дополнительного объектива вводит ограничения как в систему формирования изображения, так и в установку образца. В сущности, микроскоп должен быть сконструирован вокруг образца, поэтому существует большое разнообразие конструкций микроскопов для осуществления плоскостного освещения, каждая из которых оптимальна для разных образцов и различных требований к монтажу. Напротив, традиционные конфокальные или эпифлуоресцентные микроскопы имеют один оптический путь и могут вместить гораздо более широкий спектр образцов. Другими словами, преимущества метода SPIM микроскопии достигаются за счет более узкой применимости любого отдельного инструмента и это привело к взрывному росту числа различных конфигураций микроскопа плоскостного освещения, каждая из которых имела свои преимущества и недостатки.
Создание плоскостного освещения
Существует два основных подхода к созданию плоскостного освещения. Цилиндрическую линзу или аналогичный оптический элемент можно использовать для фокусировки света по одной оси (толщина плоского «листа» света), оставляя его рассеянным по другой оси (ширина плоского «листа» света), таким образом освещая все поле зрения одновременно. Это обычно называют «статическим» листом света. Другой метод заключается в использовании гальванического зеркала для сканирования луча света по полю съемки во время каждой экспозиции камеры, иногда называемым «цифровым» или «сканирующим» "листом" света. У каждого подхода есть свои преимущества и недостатки. Статические листы света распределяют дозу возбуждения во времени, что может уменьшить фотоповреждение. Они являются менее сложными для генерации. Однако интенсивность освещения обычно не постоянна по полю съемки из-за источника света в виде гауссовского луча. Цифровые "листы" однородны по легко изменяемой ширине, имеют эффект «стоп-движения», который полезен для перемещения образцов, и могут быть синхронизованы со строковым затвором камеры для создания 1D конфокальности. Благодаря считыванию показаний камерой sCMOS статические "листы" обычно могут достигать более высокой частоты кадров. Но строковый затвор камеры позволяет одновременно работать с несколькими световыми "листами" в схемах с несколькими проекциями исследуемого образца.
Идеальный световой "лист" должен быть чрезвычайно тонким, с интенсивностью, полностью ограниченной фокальной плоскостью объектива обнаружения, и достаточно длинным, чтобы охватить все поле зрения оптической системы визуализации. Но физика процесса мешает получить лист света такой формы. Расфокусированный свет расходится, поэтому чем тоньше лист света, тем короче тонкая область. Расстояние, на котором лист света является относительно тонким, называется конфокальным расстоянием и обычно увеличивается квадратично с увеличением толщины листа света. На практике конфокальное расстояние обычно соответствует размеру образца или поля зрения.
Чаще всего лист света имеет приблизительно гауссов профиль, потому что лазерный источник излучает гауссов луч. Для случая статического "листа" света этот гауссов профиль располагается в направлении фокусировки, математически так же, как и при сканировании гауссова пучка. Толщина и конфокальное расстояние гауссова луча/листа "света" могут быть получены аналитически как:
Толщина перетяжки = k1 * λ / NAill,
Конфокальное расстояние = k2 * λ / (NAill) 2
где k1 и k2 - безразмерные константы и зависят от выбранных толщины и конфокального расстояния, λ - длина волны в вакууме, а NAill - числовая апертура луча освещения. Для общих определений k1 = k2 = 0.64. Числовая апертура NA освещения может быть не больше, чем числовая апертура световой оптики, но чаще всего составляет лишь небольшую ее часть, так что конфокальное расстояние достаточно велико, как объяснено ранее.
Негауссовы пучки были использованы для генерации "листов" света, включая бесселевые, эйри и массивы бесселевых пучков. Лучи Бесселя и Эйри обладают крайне желательным свойством быть недифрагирующими или самовосстанавливающимися, что уменьшает затенение. Лучи Бесселя намного тоньше относительно софокусного расстояния, чем гауссовские лучи, но включают значительное большее количество света возбуждения за пределами центральной тонкой доли, увеличивая фотоповреждение образца. Массивы пучков Бесселя можно использовать там, где шаг массива минимизирует расфокусированный свет благодаря деструктивным помехам («решетке»), которые могут иметь превосходную эффективность, но требуют очень сложной оптики для формирования световых "листов" и очень чувствительны к рассеянию и аберрациям образца. Помехи могут использоваться для уменьшения толщины светового листа в более простых схемах. Фундаментальный компромисс между конфокальным расстоянием и тонкостью листа света сохраняется для негауссовых лучей, только с другим масштабным коэффициентом.
Непрозрачные области в образце могут блокировать световой лист, что приводит к появлению полос-артефактов, которые являются тенями, куда свет освещения никогда не попадает. Этот эффект может быть уменьшен путем поворота светового листа с помощью гальванического сопряжения на плоскость формирования изображения.
Для сбора трехмерной или объемной информации либо световой лист должен перемещаться через образец, либо образец перемещается через световой лист, чтобы создать "стопку" изображений. Световой лист можно перемещать с помощью гальванического зеркала, а фокальную плоскость объектива обнаружения необходимо перемещать в тандеме (обычно с пьезоэлементом). Альтернативно, образец может перемещаться через пространственно-неподвижный световой лист с использованием моторизации или пьезоподвижки. Хотя скорость сбора данных во время съемки серии изображений ограничивается в основном скоростью считывания камеры и яркостью образца, пьезоподвижки предпочтительнее для получения быстрого объемного изображения, поскольку они могут возвращаться обратно в исходное положение быстрее, чем моторизованные столики. Моторизованные столики предпочтительнее для больших и/или плоских образцов.
Оптическое разрешение
Как упоминалось ранее, лучи и решетки Бесселя позволяют получать очень тонкие световые "листы". Лучи Бесселя и подобные лучи страдают от большого количества света вне фокуса объектива, но могут быть полезны для мультифотонной микроскопии и образцов, где преодоление теневых артефактов более важно, чем избыточное фотоповреждение. Решетки очень чувствительны к аберрациям, вызванным образцом, но могут быть полезны при исследовании небольших образцов.
Латеральное (XY) разрешение такое же, как в случае широкопольной микроскопии, и обратно пропорционально числовой апертуре объектива обнаружения. Латеральное разрешение обычно намного лучше, чем аксиальное разрешение, так же, как и в других методах микроскопии.
Аксиальное (Z) разрешение является более сложным. Аксиальное разрешение базовой линии представляет собой глубину резкости объектива обнаружения, которая обратно пропорциональна квадрату числовой апертуры объектива обнаружения. Тем не менее, аксиальное разрешение может быть улучшено, если световой лист тоньше, чем глубина резкости. Эффективное аксиальное разрешение - это конволюция функции рассеяния точки возбуждения и регистрации (функция рассеяния точки освещения на самом деле незначительно изменяется из-за расходимости светового листа, но может быть аппроксимирована как перетяжка луча).
Если числовая апертура объектива обнаружения является малой (например, 0.2), то глубина резкости настолько велика, что обычно можно создать световой лист, достаточно тонкий для улучшения аксиального разрешения. Однако даже в этом случае аксиальное разрешение, как правило, остается низким по сравнению с латеральным разрешением.
Для объективов обнаружения с высокой числовой апертурой (например, NA 0.5 и выше) глубина резкости составляет несколько микрон, и трудно создать световые листы, более тонкие, чем те, что практически больше поля зрения. В этой ситуации световой лист несколько толще, чем глубина резкости, поэтому аксиальное разрешение такое же, как для широкопольного изображения, а оптическое сечение полезно, но несовершенно. Таким образом, деконволюция полученных данных может улучшить качество получаемого изображения, перенаправляя несфокусировочный свет на источник.
Если изображение образца снимается из разных точек обзора, то эти отдельные наборы 3D-данных могут быть объединены в один набор 3D-данных с улучшенным разрешением. Например, в diSPIM системе собираются две ортогональных проекции одного и того же образца, причем каждый вид имеет хорошее латеральное разрешение и плохое аксиальное разрешение. Однако каждое аксиальное направление соответствует латеральному направлению на другой проекции. После регистрации и совместной деконволюции можно сгенерировать один набор данных с изотропным «латеральным» разрешением. Тот же самый подход обычно применяется к образцам, которые чередуются между коллекциями изображений из разных видов. Постобработка данных часто требует гораздо больше времени и усилий, чем сбор данных, но ее необходимо выполнять только для хорошо известных наборов данных (с помощью просмотра отдельных стеков аниотропных материалов). Кроме того, регистрация с нескольких точек обзора требует, чтобы образец был существенно идентичным между ними, то есть он не мог значительно перемещаться или деформироваться.
Решение от компании ASI
Компания Applied Scientific Instrumentation (ASI) применяет модульный подход к конструированию микроскопов уже более десяти лет. Модульные компоненты компании ASI могут быть легко объединены для создания полноценного SPIM микроскопа, включая моторизованные предметные столики и пьезоподвижки, оптику и лазерные сканеры для создания и перемещения светового листа. Линзы объективов, лазеры, фильтры и камеры необходимы для завершения модульной системы селективной микроскопии плоскостного освещения.
Компания Applied Scientific Instrumentation предлагает микроскопы для плоскостного освещения в нескольких стандартных конфигурациях, включая iSPIM, diSPIM, oSPIM и ct-dSPIM. Кроме того, использование компонентов ASI значительно упрощает создание нестандартных систем освещения.
Пожалуй, наиболее сложным аспектом реализации микроскопа со световым листом является синхронизация между собой различных компонентов, включая перемещение образца, камеру, лазеры и перемещение луча света для создания светового листа. Эти события синхронизации со временем менее миллисекунды обрабатываются контроллером ASI в соответствии с настройками, ранее отправленными через последовательные команды. Кроме того, компания ASI внесла вклад в создание бесплатного плагина для Micro-Manager с открытым исходным кодом, который позволяет легко настраивать соответствующие параметры контроллера и получать наборы данных SPIM.
