Сравниваем электронную и световую микроскопию: когда мельчайшие детали имеют значение

Микроскопы открывают путь в невидимый мир, позволяя рассматривать мельчайшие детали жизни на клеточном и субклеточном уровнях. На протяжении столетий традиционная световая микроскопия была и остаётся основным инструментом лабораторий для визуализации клеток и их структур. Однако с появлением электронной микроскопии стало возможным заглянуть на принципиально новый уровень детализации — вплоть до отдельных ядерных пор или двойной спирали ДНК, имеющей диаметр всего около 2 нм.

Одно фундаментальное различие лежит в основе этих двух типов микроскопов: тип пучка, используемого для освещения образца. Именно этот фактор определяет конструкцию приборов, принципы их работы и области применения. Давайте рассмотрим и сравним традиционный световой микроскоп и электронный микроскоп более подробно.

От световых волн к электронным пучкам: как работают обе технологии

Традиционный световой микроскоп, также называемый оптическим, — это универсальный и широко распространённый инструмент, использующий видимый свет с длиной волны 400–700 нм для освещения образца. Взаимодействие видимого света с биологическим объектом приводит к поглощению, прохождению или отражению света, а полученное изображение увеличивается с помощью системы объективов и окуляров.

Конфигурация оптических микроскопов может различаться в зависимости от задачи, однако базовая схема включает конденсор для фокусировки света на образце, объектив и окуляры для увеличения (рис. 1). Различные типы микроскопов — например, тёмнопольные и флуоресцентные — предоставляют специализированные возможности для изучения определённых клеточных структур.

Сегодня передовым направлением в световой микроскопии является технология MINFLUX. Обладая разрешающей способностью на уровне нескольких нанометров, она проникает в область, которая ранее считалась доступной исключительно электронной микроскопии. Более того, в отличие от электронных методов, MINFLUX позволяет исследовать живые образцы и динамику молекул

Теперь рассмотрим принцип работы электронного микроскопа. Электронный микроскоп использует пучок электронов для выявления мельчайших деталей структуры образца. Работа прибора осуществляется в вакууме, а фокусировка и увеличение электронного пучка выполняются с помощью магнитных линз — конденсорной, объективной и проекционной (рис. 1). Изображение формируется за счёт прохождения или рассеяния электронов.

В просвечивающей электронной микроскопии (TEM) электроны проходят сквозь ультратонкий образец и формируют изображение на флуоресцентном экране или детекторе. Сканирующая электронная микроскопия (SEM), в свою очередь, создаёт псевдотрёхмерные изображения, последовательно сканируя поверхность образца сфокусированным электронным пучком.

Рисунок 1. Сравнение схемы традиционного светового микроскопа, просвечивающего и сканирующего электронного микроскопа.

Длина волны определяет разрешение

Традиционные оптические микроскопы обеспечивают увеличение до 1500×. Однако их разрешающая способность ограничена длиной волны видимого света. Эффективность оптических линз снижается при работе на коротких длинах волн (≈400 нм), а дифракционный предел Аббе ограничивает разрешение примерно половиной длины волны. В результате структуры меньше ~200 нм в латеральном направлении и 600–700 нм по оси z становятся неразличимыми, и многие субклеточные элементы остаются недоступными для наблюдения.

Электронные микроскопы, напротив, обладают значительно более высоким разрешением, достигая увеличения до 1 000 000× и субнанометрового уровня — примерно в 250 раз лучше, чем у традиционных световых микроскопов. В чём причина? Образец освещается электронами, длина волны которых намного меньше, чем у фотонов. При ускоряющем напряжении 200 кэВ длина волны электронов составляет около 2,5 пм — пикометрический диапазон. Благодаря этому становятся различимыми детали вирусов (30–250 нм), белков (~10 нм) и даже молекул глюкозы (~1 нм).

В электронных микроскопах предел разрешения определяется уже не длиной волны, а качеством электромагнитных линз, которые невозможно сформировать столь же точно, как оптические линзы в световой микроскопии.

Рисунок 2. Примеры изображений, полученных с помощью световой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии (SEM) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM). Слева: световая микроскопия позволяет легко различать клеточные структуры, такие как хромосомы в клетках лука. В центре: SEM идеально подходит для детального изучения поверхности (на изображении — тромб). Справа: TEM обеспечивает субнанометровое разрешение и позволяет рассматривать, например, вирусы, такие как вирус эпидемической диареи свиней.

А что с живыми образцами?

Здесь безусловным лидером является световая микроскопия. Она позволяет работать с широким спектром образцов — живыми и неживыми, фиксированными и нефикисированными, окрашенными и неокрашенными, толщиной в несколько микрометров. Свет свободно проходит через прозрачные биологические объекты, что даёт возможность наблюдать живые клетки в реальном времени.

Подготовка образцов относительно проста и занимает от нескольких минут до нескольких часов. Окрашивание цветными красителями или флуорофорами повышает контраст и позволяет специфически метить определённые структуры; при этом можно использовать несколько цветов одновременно для визуализации разных мишеней. После монтажа на предметное стекло с покровным стеклом образец готов к исследованию.

Электронная микроскопия исключает возможность работы с живыми образцами. Кроме того, привычные для световой микроскопии красители и метки здесь неприменимы. Образцы должны быть ультратонкими (обычно ≤0,1 мкм) и проходят сложный многоэтапный процесс подготовки: фиксацию, дегидратацию, контрастирование тяжёлыми металлами и монтаж на медную сетку. Такая подготовка трудоёмка, требует высокой квалификации, занимает несколько дней и делает сохранение жизнеспособности образца невозможным.

Сравнение световой и электронной микроскопии

Фотон против электрона: дуэль микроскопий?

И световая, и электронная микроскопия играют важную роль в науке, раскрывая разные аспекты жизни на различных масштабах. Световые микроскопы ценятся за простоту, удобство использования, компактность, возможность полевых исследований, доступную стоимость и низкие эксплуатационные расходы.

Электронные микроскопы, в свою очередь, обеспечивают несравнимо более высокое увеличение и субнанометровое разрешение, позволяя напрямую наблюдать молекулярный мир. Однако за это приходится платить высокой стоимостью оборудования, необходимостью специально оборудованных помещений и работы в условиях, несовместимых с исследованием живых образцов. Возникает вопрос: можно ли объединить преимущества обоих подходов?

Выход за пределы

Помимо классических световых и электронных микроскопов, современная микроскопия включает методы сверхразрешения, которые обходят дифракционный предел Аббе и позволяют исследовать структуры в нанометровом диапазоне и ниже. Одной из наиболее передовых технологий является MINFLUX.

Особенно важно, что MINFLUX работает там, где электронная микроскопия бессильна: при исследовании живых образцов и динамики отдельных молекул. Многоцветная MINFLUX-визуализация позволяет изучать двумерное и трёхмерное распределение молекул в живых клетках с разрешением 1–3 нм. Метод успешно применялся для визуализации отдельных молекул в пероксисомах, мембранах митохондрий, фоторецепторах, нейронах и ядерных порах (рис. 3).

Благодаря временному разрешению менее 1 мс MINFLUX также позволяет фиксировать конформационные изменения молекул, такие как пошаговое движение кинезина-1 вдоль микротрубочек [Deguchi, T. et al. 2023, Wolff, J. O. et al. 2023] или активацию механочувствительного ионного канала PIEZO1 [Mulhall, E. M. et al. 2023]. Простота подготовки образцов и относительная доступность делают эту технологию мощным и практичным инструментом.

Рисунок 3. Просвечивающая электронная микроскопия (слева) и световая микроскопия MINFLUX (справа) достигают одноцифрового нанометрового разрешения, раскрывая кольцевую архитектуру ядерных поровых комплексов.