STED и конфокальная микроскопия — братья-близнецы

С 1990-х годов конфокальные микроскопы стали неотъемлемым инструментом лабораторий, работающих с биологическими и материаловедческими образцами. Однако примерно с 2010 года в научной литературе наблюдается резкий рост числа публикаций, посвящённых сверхразрешающей микроскопии, где STED уверенно вышла на лидирующие позиции. Это развитие закономерно привело к вопросу: как проверенный временем конфокальный микроскоп соотносится с (уже не таким уж) «новичком» — STED? Подсказка: вам стоит (и вы можете) использовать оба метода.

На самом деле нет одной-единственной причины, по которой конфокальная микроскопия превосходит классическую широкопольную. Здесь работает совокупность факторов. Разрешение у конфокального микроскопа действительно выше, но главное его преимущество — существенно улучшенное оптическое секционирование.

Оптическое секционирование — это способность формировать чёткое изображение фокальной плоскости, то есть той области образца, на которую сфокусирован объектив микроскопа, за счёт подавления сигнала из внефокусных областей.

Проще всего понять принцип оптического секционирования на примере простой структуры — двух клеточных мембран, расположенных одна над другой. Если одна мембрана находится точно в фокальной плоскости микроскопа, мы, в принципе, должны видеть её ярко и чётко. Но что происходит со второй мембраной, находящейся вне фокуса? Без оптического секционирования размытый свет от этой мембраны будет накладываться на сигнал от первой. В результате мы увидим обе структуры одновременно, не имея возможности их различить.

При идеальном оптическом секционировании, напротив, внефокусная мембрана будет полностью тёмной, что резко снижает фоновый сигнал на изображении.

Сравнение конфокальной и STED-микроскопии

Сравнение «лоб в лоб», представленное в таблице ниже, подчёркивает различия между двумя методами, которые могут влиять на выбор технологии для конкретных задач. Однако эксперты компании abberior считают такое противопоставление не совсем корректным. Обе технологии имеют своё законное место в научных исследованиях. Более того, они неразрывно связаны между собой.

Ключевая особенность STED-системы — использование дополнительного бубликообразного светового пучка (STED-пучка) наряду с возбуждающим пучком. Если убрать STED-пучок, вы фактически получите стандартный конфокальный микроскоп.

Благодаря фокусированному освещению, интенсивному флуоресцентному сигналу и пинхольной фильтрации конфокальный микроскоп обеспечивает превосходное оптическое секционирование и возможность 3D-реконструкции подходящих образцов.

STED-микроскопия делает то же самое — но с разрешением до 10 раз выше.

Параметр	Конфокальная микроскопия	STED-микроскопия
Принцип	Лазерное сканирование; пинхол отсекает свет от внефокусных областей образца	То же самое + ограничение сигнала субдифракционной областью за счёт вынужденного излучения
XY-разрешение	~200 нм	До 20 нм
Z-разрешение	~600 нм	До 75 нм
Временное разрешение	>100 кадров/с	28 кадров/с
Тип образцов	Фиксированные и живые клетки и ткани	Фиксированные и живые клетки и ткани
Толщина образца	>100 мкм (с RAYSHAPE)	>100 мкм (с RAYSHAPE)

Революция сверхразрешения

Коммерциализация STED-микроскопии и других методов сверхразрешения ознаменовала начало эпохи наноскопии — времени, когда световая микроскопия позволяет изучать не только структуру, но и динамику жизни с беспрецедентной детализацией. STED открыла субдифракционный мир биологических структур, которые конфокальные микроскопы не могли различить, и при этом метод применим к живым системам.

Сегодня исследователи визуализируют полосатый рисунок βIV-спектрина в аксонах, взаимодействие SNAP25 с другими белками аппарата слияния синаптических везикул, сложную архитектуру крист митохондрий во время их деления и слияния, а также ультраструктуру цитоскелета, микроворсинок кишечника и волосковых клеток внутреннего уха.

Как STED достигает этого?

Как уже упоминалось, STED-система — это стандартный конфокальный микроскоп, в котором используются два совмещённых световых пучка. Первый возбуждает флуоресцентные метки, заставляя их испускать фотоны. Как и в конфокальной микроскопии, этот свет дифрагирует в области около 200 нм, что делает более мелкие структуры неразличимыми.

Затем в игру вступает второй, бубликообразный пучок. Везде, где его интенсивность отлична от нуля, он принудительно переводит возбуждённые молекулы обратно в основное состояние, фактически «заглушая» их излучение. Молекулы в центральном «отверстии бублика», где STED-свет отсутствует, остаются незатронутыми и испускают регистрируемые фотоны (подробнее о принципе работы STED можно прочитать отдельно).

Таким образом, STED использует бубликообразный пучок для ограничения области излучающих молекул до размеров, значительно меньших 200 нм, обеспечивая субдифракционное разрешение. Если уменьшить мощность STED-пучка до нуля, система превращается в обычный конфокальный микроскоп с дифракционно ограниченным разрешением.

Интенсивность STED-воздействия формирует непрерывный спектр между двумя методами: конфокальная микроскопия — дифракционно ограничена, STED — нет. Возможны любые промежуточные режимы: от полного отсутствия STED до мягкого низкомощного STED, дающего, например, трёхкратный прирост разрешения почти без воздействия на образец, и вплоть до сверхвысокого сверхразрешения (пусть и с меньшей скоростью и уровнем сигнала).

Общие инновации, рождающие новые возможности

Гораздо интереснее, чем противопоставлять STED и конфокальную микроскопию, рассматривать спектр возможностей, возникших благодаря эволюции STED. Прирост разрешения — безусловное преимущество, но разработка и совершенствование компонентов и аналитических инструментов для STED-систем abberior стали источником инноваций, которые вдохновляют не только поклонников STED, но и убеждённых пользователей конфокальной микроскопии.

Улучшения, созданные для STED, зачастую решают задачи, общие и для конфокальных микроскопов. Вот несколько примеров.

RAYSHAPE: коррекция аберрации

Биологические образцы часто гетерогенны. Мы помещаем эту неоднородность в среду для заливки, освещаем её через иммерсионную среду и удивляемся, почему конфокальный или STED-микроскоп не даёт ожидаемого качества изображения. Несоответствие показателей преломления различных сред и неоднородность самого образца вызывают искажение хода света. В результате ухудшается фокусировка, а излучение флуорофоров также отклоняется. Совокупно эти эффекты всё сильнее подавляют и размывают сигнал по мере увеличения глубины сканирования.

RAYSHAPE использует деформируемое зеркало, которое возвращает отклонённый свет туда, где ему и положено быть. 140 цифрово управляемых актуаторов с миллисекундной скоростью точно изменяют форму поверхности зеркала, динамически корректируя аберрации на разных глубинах по мере перемещения фокальной плоскости.

Будь то конфокальная или STED-микроскопия — с RAYSHAPE можно попрощаться с аберрациями!

Больше информации из каждого фотона с TIMEBOW

Флуоресцентная микроскопия с измерением времени жизни (FLIM) использует различия в скорости затухания флуоресценции как дополнительный источник информации об образце. Хотя FLIM давно применяется в стандартной флуоресцентной микроскопии, её совместимость с STED известна гораздо меньше.

TIMEBOW — модуль abberior для бесшовной регистрации и анализа данных о времени жизни флуоресценции — работает в связке с детектором MATRIX, обеспечивая одновременное получение точной временной и пространственной информации. Одновременная регистрация времени жизни фотона и его пространственного происхождения позволяет эффективно устранять фон и получать насыщенные, высококонтрастные изображения.

Дополнительным преимуществом является рост разрешения, который позволяет снизить интенсивность возбуждающего пучка как в конфокальной, так и в STED-микроскопии. В итоге вы получаете больше информации и одновременно бережёте образец и флуорофоры.

Стереозрение в регистрации сигналов с MATRIX

И конфокальные, и STED-микроскопы сталкиваются с фоном при работе с толстыми образцами. Пинхол конфокального микроскопа не может полностью устранить внефокусный сигнал, а STED эффективно подавляет низкочастотный сигнал в фокальной плоскости, но практически не влияет на фон.

Точечный детектор в обоих случаях регистрирует одновременно полезный сигнал и фон. Даже сложные алгоритмы деконволюции лишь частично компенсируют фон и могут приводить к артефактам.

Решение — массив детекторов, «смотрящих» на образец под немного разными углами, подобно тому как бинокулярное зрение позволяет различать объекты на переднем и заднем плане. MATRIX — это несколько высокоэффективных лавинных фотодиодов (APD), расположенных в виде гексагональной решётки на одном чипе. MATRIX измеряет и вычитает фон для каждого пикселя, обеспечивая существенно более чистые изображения как в конфокальной, так и в STED-микроскопии.

Адаптивное освещение с модулем FLEXPOSURE

Одним из фундаментальных компромиссов флуоресцентной микроскопии — особенно при работе с живыми образцами — является повреждение флуорофоров и тканей из-за длительного воздействия интенсивного света. При этом большинство образцов разрежены, и лишь небольшие области представляют интерес для визуализации. Зачем освещать пустое пространство?

FLEXPOSURE — это адаптивное освещение, которое минимизирует фотообесцвечивание и фототоксичность, подавая свет только туда, где он действительно нужен. FLEXPOSURE объединяет различные методы адаптивного освещения, которые пошагово анализируют структуру образца с помощью низкоинтенсивного конфокального и STED-зондирования, чтобы определить области, требующие полного освещения.

Использование FLEXPOSURE снижает световую нагрузку на образец, облегчая эксперименты с живыми клетками, получение изображений высокого разрешения и улучшение качества сигнала. FLEXPOSURE применим как для STED, так и для конфокальной визуализации.

Берегите образец — снижайте дозу света с FLEXPOSURE.

Как обеспечить будущее вашей лаборатории?

Безусловно, STED-микроскопия находится в центре деятельности компании abberior. Каждое решение, которое специалисты превращают в функциональность, мощь и элегантность наших инструментов, направлено на получение чётких и точных представлений о наноскопическом мире. Некоторые разработки являются эксклюзивными для наших сверхразрешающих систем — например, однопучковая архитектура Easy3D STED, устраняющая потери сигнала и разрешения из-за несоосности пучков.

Однако многочисленные улучшения, применимые и к конфокальной микроскопии, показывают, что появление революционных технологий вроде STED запускает волну инноваций, распространяющуюся далеко за их пределы. В этом смысле STED-микроскопы abberior — это не только передовые системы сверхразрешения, но и первоклассные конфокальные микроскопы.

Как пользователь, вы можете свободно настраивать разрешение под свои задачи — от 200 до 20 нм и любых значений между ними.