Арт. STEDYCON 2
STED + PAINT = идеальная пара
Микроскопия со стимулированным подавлением излучения (STED, Stimulated Emission Depletion) обеспечивает пространственное разрешение лучше 20 нм. Благодаря значительному прогрессу в развитии инструментов для STED-микроскопии и коммерциализации новых фотостабильных красителей, STED сегодня стала широко доступной технологией. Однако, несмотря на то что STED в теории обеспечивает неограниченное разрешение, на практике существенную роль начинает играть фотообесцвечивание. Для снижения его влияния часто приходится уменьшать разрешение или ограничивать количество временных точек и размер регистрируемых 3D-объёмов. Помимо адаптивного освещения, одним из решений, позволяющих обойти физические ограничения современных технологий мечения, является адаптация концепции PAINT (point accumulation for imaging in nanoscale topography) к STED-микроскопии.
Метод PAINT основан на использовании сменяемых меток, которые лишь временно связываются с целевыми структурами. В процессе съёмки такие метки постоянно пополняются из большого пула флуорофоров в иммерсионной среде, что обеспечивает стабильную яркость образца даже при максимальном разрешении.
Разрешение STED-микроскопа масштабируется с интенсивностью STED-лазера. К сожалению, повышение разрешения зачастую сопровождается усилением фотообесцвечивания. Доступный «фотонный бюджет» флуоресценции тем самым ограничивает как таймлапс-съёмку, так и объёмную визуализацию. При временной съёмке один и тот же участок образца многократно освещается, и количество активных флуорофоров уменьшается с каждым циклом. Аналогично, при объёмной съёмке соседние z-плоскости регистрируются последовательно, в результате чего каждая плоскость подвергается многократному освещению и частичному фотообесцвечиванию. В итоге микроскопистам часто приходится жертвовать либо разрешением, либо числом временных точек, либо количеством z-срезов, чтобы снизить обесцвечивнаие до приемлемого уровня.
Описанная ситуация была особенно характерна для ранних реализаций STED-микроскопии, когда интенсивное освещение образца сочеталось с ограниченным набором фотостабильных флуорофоров. Сегодня же значительные достижения в области STED-инструментов — такие как использование оптимизированных импульсных STED-лазеров [Göttfert F. Et al., 2013], высокоэффективная регистрация с помощью лавинных фотодиодов (APD), а также адаптивное освещение [Göttfert F. et al., 2017; Heine, J. et al. 2017; Staudt, T.et al., 2011] — позволяют существенно снизить нагрузку на образец. Современные STED-микроскопы обеспечивают разрешение <20 нм и позволяют проводить съёмку живых клеток и трёхмерных стеков изображений. Одновременно на рынке представлен широкий ассортимент оптимизированных, ярких и фотостабильных флуорофоров для STED-визуализации, доступных с различными химиями конъюгации для самых разных приложений [Butkevich A.N., et al. 2017; Butkevich, A.N., et al., 2016; Kolmakov, K., et al. 2014; Sidenstein, S.C., et al, 2016; Wurm, C.A., et al. 2012].
Тем не менее, достижимое разрешение и количество регистрируемых кадров по-прежнему в конечном счёте ограничены обесцвечиванием, пусть и на значительно более высоком уровне, чем несколько лет назад.
В то же время метод PAINT позволяет подавить или обойти процесс фотообесцвечивания и тем самым обеспечить дополнительный прирост разрешения, а также расширенные возможности таймлапс- и объёмной визуализации. В классической PAINT-микроскопии отдельные временно связывающиеся молекулы красителя локализуются с высокой точностью с использованием методов одно-молекулярной локализационной микроскопии [Schnitzbauer, J., et al, 2017; Sharonov, A., Hochstrasser, R.M., 2006]. Ключевым преимуществом является постоянный обмен флуорофоров: выгоревшие молекулы заменяются новыми из большого резервуара в среде визуализации благодаря использованию меток с транзиторным связыванием. Это обеспечивает быстрый и непрерывный обмен флуорофоров в ходе регистрации изображения.
Недавно Spahn и соавторы [Spahn, C., 2019] успешно адаптировали сменяемые флуорофоры для применения в STED-микроскопии. В отличие от классического PAINT, где требуется крайне малое число связанных красителей в каждый момент времени, окрашивание для STED было оптимизировано таким образом, чтобы обеспечивать высокую плотность связанных флуорофоров при сохранении возможности их быстрого пополнения из среды визуализации. Примечательно, что данный подход может быть реализован с использованием широкого спектра методов окрашивания, включая простые липофильные красители, красители для ДНК, токсино- и пептид-конъюгированные флуорофоры, а также иммуноокрашивание с использованием антител, меченных ДНК.
Примеры применений
Ниже приведены примеры и протоколы, которые дают практическое введение в метод и могут служить отправной точкой для собственных исследований. Подробное описание различных подходов представлено в Приложении 1.
Рисунок 1. STED-PAINT-визуализация бактериальных мембран (пурпурный) и ДНК (зелёный) с использованием высокой концентрации сменяемых меток Nile Red и JF646-Hoechst. (A) Накопление кадров, возможное благодаря обмену красителей, обеспечивает более высокую яркость изображения и позволяет различить детали, которые в противном случае теряются на фоне шума (стрелка). (B) Пополнение красителей позволяет проводить многократную объёмную съёмку с 3D-сверхразрешением. В нижнем ряду для наглядности показан изолированный канал ДНК. Масштабная линейка — 1 мкм.
Бактериальные мембраны и ДНК
В первом примере визуализации (рис. 1) бактериальные мембраны и ДНК были зарегистрированы методом STED-PAINT-микроскопии. Для мечения фиксированных бактериальных клеток была выбрана комбинация двух красителей, ранее показавших высокую эффективность в подходе STED-PAINT: липофильный краситель Nile Red для окрашивания мембран и конъюгат ДНК-связывающего красителя JF646-Hoechst. Аналогичные результаты могут быть получены с использованием SiR-Hoechst [Spahn, C., 2019; Lukinavičius, G., 2015]. В соответствии с общей концепцией красители добавлялись непосредственно в среду визуализации в концентрациях порядка 300 нМ.
Небольшие размеры бактериальных клеток существенно ограничивают возможности световой микроскопии при различении внутриклеточных бактериальных органелл или макромолекулярных комплексов, не говоря уже об определении их формы или распределения белков внутри клетки. Тем не менее, многие клеточные процессы протекают с участием специализированных структур, требующих более высокого пространственного разрешения для адекватной визуализации, как, например, процесс деления клетки с образованием кольца FtsZ. В таких случаях оптическая сверхразрешающая микроскопия позволяет не только разрешить кольцевую структуру, но и, благодаря многоцветным возможностям, выявить взаимодействие ключевых компонентов процесса [Söderström, B., 2018]. Однако для изучения подобных динамических процессов с высоким разрешением во времени необходимы подходы типа PAINT.
Образец
Клетки E. coli, зафиксированные в середине экспоненциальной фазы роста (2 % формальдегид / 0,05 % глутаровый альдегид), промывали в PBS, иммобилизовали на покровных стёклах, очищенных KOH и обработанных поли-L-лизином, после чего пермеабилизовали с использованием 0,5 % Triton X-100. Окрашивание и съёмка проводились в среде, содержащей 300 нМ Nile Red и 300 нМ JF646-Hoechst в 150 мМ Tris, pH 8,0, при комнатной температуре.
Съёмка
Для Nile Red характерно быстрое пополнение, тогда как JF646-Hoechst обновляется медленнее. Благодаря малым размерам бактерий данный объект хорошо подходит для подхода 2 с использованием небольших полей зрения, которые можно регистрировать с высокой скоростью. При высоких скоростях съёмки дрейф предметного столика не представляет существенной проблемы. Для 2D-STED накапливали 17 и более кадров изображения для повышения отношения сигнал/шум (рис. 1A). Для объёмной визуализации с 3D-сверхразрешением регистрировали плотно расположенные z-плоскости (размер вокселя: 50 × 50 × 50 нм) без заметного фотообесцвечивания даже после съёмки десяти полных объёмов.
Пример настроек 2D-STED
Подход 2; размер кадра 5,6 × 6,8 мкм (XY); размер пикселя 30 нм (XY); время задержки (dwell time) 10 мкс; Nile Red — 15–23 % мощности возбуждения на 561 нм и 40 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности); JF646-Hoechst — 4–4,5 % возбуждения на 640 нм и 10 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности); накопление по строкам 1× (конфокальный режим) / 3× (STED); накопление сигнала по кадрам ≥17×.
Пример настроек 3D-STED
подход 1; размер объёма 2,4 × 2,4 × 2,5 мкм (XYZ); размер пикселя 50 нм (XYZ); Nile Red — как указано выше; JF646-Hoechst — 5–6,2 % возбуждения на 640 нм и 20 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности); накопление по строкам 1× (конфокальный режим) / 3× (STED).
Рисунок 2. STED-PAINT-визуализация клетки HeLa, меченной Nile Red, обеспечивает яркие изображения мембран митохондрий, а также широкого спектра других клеточных мембран, включая эндоплазматический ретикулум, плазматическую мембрану, везикулы и липидные капли. Пополнение красителя в процессе съёмки позволяет получать яркие STED-изображения без фотообесцвечивания. Показаны необработанные данные.
Митохондриальные мембраны в фиксированных и живых клетках млекопитающих
Визуализация структуры и динамики внутренней мембраны митохондрий в настоящее время является одной из наиболее актуальных задач в биологии органелл. Помимо мечения митохондриальных белков с использованием малых тегов, таких как SNAP-тег [Kondadi, A.K., 2020], опубликованы результаты, полученные с применением митохондриально-специфичных зондов [Almeida, A.C., 2020].
Кроме того, Spahn и соавт. [Spahn, C., 2019] описали использование Nile Red для мечения и визуализации широкого спектра клеточных мембран, а также липидных капель. Среди прочих результатов они показали, что данный краситель эффективно метит митохондриальные мембраны и позволяет выявлять внутреннюю структуру крист (рис. 2). Однако из-за широкой специфичности красителя для однозначной идентификации интересующих структур может потребоваться дополнительное контрастное окрашивание.
Образец
Клетки HeLa, зафиксированные в течение 60 минут в буфере PHEM с использованием 4 % формальдегида и 0,1 % глутарового альдегида (адаптировано из источника [Legant, W.R., 2016]), окрашивали и визуализировали с использованием 300 нМ Nile Red в 150 мМ Tris, pH 8,0, при комнатной температуре.
Примечание
Для сохранения мембранных структур образец следует фиксировать не менее 60 минут смесью формальдегида и глутарового альдегида и не подвергать клетки пермеабилизации.
Съёмка
Nile Red быстро пополняется и хорошо подходит для подхода 1 (см. стр. 6). Поскольку для достижения достаточного пространственного разрешения Nile Red требует относительно высокой мощности STED-лазера, фотообесцвечивание играет доминирующую роль, а обмен красителя становится критически важным. Для сбора достаточного сигнала, несмотря на фотообесцвечивания, требуется многократное накопление по строкам при сравнительно низких скоростях сканирования (например, за счёт увеличения времени задержки пикселя). Наиболее яркие результаты были получены при использовании больших полей зрения (>20 мкм), так как в этом случае замедляется съёмка каждой строки и увеличивается время восстановления между повторными проходами.
Пример настроек
Подход 1; размер кадра 26,2 × 27,4 мкм (XY); размер пикселя 20 нм (XY); время задержки (dwell time) 10 мкс; 2–10 % мощности возбуждения на 561 нм; 65 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности); накопление по строкам 8× (конфокальный режим) / 24× (STED); одиночный кадр.
Рисунок 3. STED-PAINT-визуализация Lifeact Alexa Fluor 594 в фиксированных клетках HeLa обеспечивает яркие высокоразрешающие STED-изображения тонкой структуры цитоскелета, поскольку зонд связывается лишь транзиторно и постоянно пополняется из среды визуализации. Показан небольшой фрагмент большого кадра; приведены необработанные данные.
Цитоскелет в фиксированных и живых клетках млекопитающих
Цитоскелет клеток млекопитающих является удобным и наглядным тестовым объектом для практической демонстрации практически всех типов световой микроскопии. Тем не менее, множество нерешённых научных вопросов по-прежнему связано с тонкой структурой и функциями цитоскелетных сетей [Almeida, A.C., 2020; Andrade, D.M., 2015; D’Este, E., 2015].
Мечение цитоскелета на протяжении десятилетий осуществлялось с использованием иммунофлуоресценции, токсин-опосредованных методов окрашивания или подходов, основанных на GFP-мечении. Многие из этих методов хорошо подходят для анализа грубой структуры сети. Однако тонкая структура часто выглядит тусклой и плохо разрешимой. Как правило, это связано с низкой плотностью мечения тонких филаментов и/или быстрым фотообесцвечиванием.
В данной работе в фиксированных клетках млекопитающих был применён PAINT-подход с использованием пептида Lifeact [Riedl, J., 2008], конъюгированного с Alexa Fluor 594. Как показано на рис. 3, обмен меток в среде визуализации позволяет длительное накопление сигнала и выявляет значительно больше деталей тонкой организации цитоскелетной сети по сравнению с классическими образцами, меченными антителами или фаллоидином.
Образец
Клетки HeLa фиксировали с использованием буфера, стабилизирующего микротрубочки, как описано ранее [Spahn, C., 2019], для сохранения структур цитоскелета. Окрашивание и съёмка проводились при комнатной температуре с использованием 1–2 мкМ Lifeact–Alexa Fluor 594 в 100 мМ Tris, pH 8,0, с подавлением кислорода за счёт добавления 2,5 мМ PCA и 10 нМ PCD [Aitken, C.E., 2008].
Примечание
Удаление кислорода способствует защите цитоскелетных структур в процессе регистрации изображений.
Съёмка
Применялся подход 1, поскольку Lifeact Alexa Fluor 594 характеризуется быстрым обменом. Регистрация с большим числом накоплений по строкам позволила улучшить сигнал от тонких структур.
Пример настроек
Подход 1; размер кадра 73,6 × 74,6 мкм (XY); размер пикселя 20 нм (XY); время задержки (dwell time) 10 мкс; 20–50 % мощности возбуждения на 561 нм; 25 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности); накопление по строкам 8× (конфокальный режим) / 24× (STED); одиночный кадр.
STED-DNA-PAINT
Примеры, приведённые выше, демонстрируют эффективность комбинации STED-PAINT. Все они основаны на окрашивании с помощью токсинов или липидов. Тем не менее, большинство научных вопросов связано с функцией одного или нескольких специфических белков или белковых комплексов, что требует применения методов мечения, направленных на конкретные целевые белки. В большинстве случаев красители на основе токсинов недоступны или не обладают необходимой специфичностью.
Рисунок 4. Принцип DNA-PAINT позволяет объединить иммунное мечение целевых белков с подходом PAINT. Для этого необходимы три компонента: первичное антитело, связывающееся с целевой структурой, вторичное антитело, связывающееся с первичным антителом, и вторичное антитело, к которому конъюгирована одноцепочечная ДНК (docking strand). Одноцепочечная ДНК с флуорофором (imager strand) периодически связывается и отсоединяется от связанной ДНК, обеспечивая сменяемое окрашивание.
Одним из высокоспецифичных методов мечения является DNA-PAINT, основанный на классическом иммуноокрашивании [Schnitzbauer, J., 2017; Spahn, C., 2019]. В этом подходе целевой белок иммуномечен специфичными первичными антителами и вторичными антителами, конъюгированными с ДНК (docking strands). Для визуализации добавляют флуоресцентно меченные комплементарные ДНК-цепочки (imager strands), которые временно связываются с ДНК на антителах через комплементарное спаривание оснований. Такой подход позволяет расширить концепцию PAINT для более специфичного мечения белков. Важно, что кинетику связывания docking- и imager-цепочек можно тонко регулировать, изменяя последовательность ДНК, состав буфера или температуру. Это предоставляет несколько инструментов для оптимизации DNA-PAINT с целью получения ярких STED-изображений и ускоренной регистрации [Spahn, C., 2019].
Для демонстрации эффективности данного подхода была объединена простая PAINT-визуализация с Lifeact–Alexa Fluor 594 и DNA-PAINT-мечение с использованием первичных антител к тубулину, вторичных антител, конъюгированных с ДНК, и ДНК imager-цепочек, меченных флуорофором abberior STAR 635P.
В итоге результаты STED-DNA-PAINT говорят сами за себя (рис. 5). Это указывает на широкую применимость PAINT в многочисленных экспериментах с фиксированными клетками, где интерес представляет локализация одного или нескольких целевых белков. Однако концепция DNA-PAINT не совместима с визуализацией живых клеток, поэтому более динамические вопросы в области биовизуализации не могут быть решены с помощью этой технологии.
Рисунок 5. Комбинация STED-PAINT и STED-DNA-PAINT. Помимо мечения актина (как на рис. 3), тубулин был помечен в фиксированных клетках HeLa с использованием DNA-PAINT: вторичные антитела конъюгированы с ДНК, а комплементарные DNA-imager цепочки мечены abberior STAR 635P и временно связываются с ними. Оба красителя пополняются из буфера, обеспечивая яркие STED-изображения.
Образец
Клетки HeLa фиксировали с использованием буфера, стабилизирующего микротрубочки, как описано ранее [Spahn, C., 2019], для сохранения структур цитоскелета. Иммуноокрашивание проводилось с использованием мышиных первичных антител к β-тубулину (#32-2600, Thermo Fisher, США) и специализированных вторичных антител, конъюгированных с ДНК [Spahn, C., 2019]. Окрашивание и съёмка при комнатной температуре проводились с использованием 1–2 мкМ Lifeact–Alexa Fluor 594 и 500 нМ STAR 635P-конъюгированных imager-цепочек в PBS (без Ca²⁺ и Mg²⁺), с 500 мМ NaCl, pH 8,2, и подавлением кислорода с помощью 2,5 мМ PCA и 10 нМ PCD [Aitken, C.E., 2008].
Примечание
Удаление кислорода помогает защитить структуры цитоскелета во время съёмки.
Съёмка
Использовался подход 1, так как Lifeact Alexa Fluor 594 быстро обменивался, а DNA-PAINT imager-цепочка – со средней скоростью. Для усиления сигнала тонких актиновых структур использовалось большое количество накоплений по строкам. Обратите внимание, что накопления по строкам для STAR 635P меньше из-за его высокой яркости, но медленного пополнения (требуется больше пауз).
Пример настроек
Подход 1; размер кадра 51,2 × 42,2 мкм (XY); размер пикселя 20 нм (XY); время задержки (dwell time) 10 мкс; Lifeact–Alexa Fluor 594: 20–50 % возбуждения на 561 нм, 25 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности), накопление по строкам 2× (конфокальный) / 12× (STED); DNA-PAINT STAR 635P: 10–20 % возбуждения на 640 нм, 18 % STED на 775 нм (вариант высокой мощности), накопление по строкам 2× (конфокальный) / 6× (STED); одиночный кадр.
Мультицветная DNA-PAINT и STED
В последние годы были опубликованы работы по мультицветной DNA-PAINT, позволяющей получать новые биологические сведения [Jungmann, R., 2014; Schnitzbauer, J., , 2017; Spahn, C., 2019; Werbin, J.L., 2017]. В этом подходе несколько биологических мишеней окрашиваются специфическими первичными антителами, каждое из которых конъюгировано с уникальной ДНК-докинговой цепочкой. Каждая мишень визуализируется после отдельного шага окрашивания с использованием комплементарной ДНК imager-цепочки, связывающейся только с одной конкретной докинговой цепочкой. Все imager-цепочки мечены одним и тем же красителем, что позволяет использовать одинаковые настройки для каждой мишени. Важно, что между двумя раундами визуализации необходимо проводить тщательные промывки, чтобы в образце присутствовала только нужная imager-цепочка.
Альтернативно, можно одновременно добавлять imager-цепочки с различными последовательностями (и, соответственно, различной специфичностью), и различать их спектрально по длине волны возбуждения и диапазону детекции, при этом используя одну и ту же длину волны лазера для подавления (например, Alexa Fluor 594 и abberior STAR 635P). Несколько таких комбинаций уже были протестированы для приложений STED-DNA-PAINT [Spahn, C., 2019].
Кроме того, при использовании первичных антител, конъюгированных с ДНК, количество параллельных окрашиваний не ограничено набором антител разных видов, что дополнительно расширяет возможности мультиплексирования DNA-PAINT и STED-DNA-PAINT.
Хотя общая применимость этого подхода в комбинации с STED-микроскопией требует дальнейшей проверки, результаты первых экспериментов выглядят крайне многообещающими и открывают очень интересные перспективы. Недавние достижения в области DNA-PAINT, такие как SpeedPAINT [Schueder, F., 2019], могут дополнительно улучшить скорость визуализации и отношение сигнал/шум, делая PAINT-STED ещё более мощным и полезным инструментом.
Приложение 1: Процесс STED-PAINT
Метод PAINT основан на специальных условиях мечения, при которых молекулы красителя постоянно обмениваются. Это означает, что выгоревшие красители непрерывно заменяются свежими, что позволяет многократно сканировать область изображения и накапливать сигнал до тех пор, пока не будет получено яркое изображение.
Кинетика обмена красителей определяет конкретный режим визуализации и скорость съёмки, поскольку выгоревшие молекулы необходимо заменить перед началом следующего шага накопления. В результате возникают два различных подхода к визуализации — для быстрых и медленных скоростей обмена красителей.
Важно отметить, что увеличение площади изображения снижает общую скорость съёмки, что, в свою очередь, даёт больше времени для пополнения красителей между повторными сканированиями. По сути, большая площадь изображения оказывает эффект, аналогичный более быстрой скорости обмена красителей.
Подход 1: Быстрая скорость обмена красителя
Для красителей с высокой скоростью обмена почти полное восстановление окрашивания происходит в ходе сканирования одной линии при регистрации STED-изображения. Это обеспечивает постоянный высокий сигнал на каждой линии и позволяет накапливать несколько строк перед переходом к следующей. Обратите внимание, что для больших изображений сканирование каждой линии занимает больше времени, что улучшает восстановление красителя. Яркость финального изображения, как правило, высокая и в основном зависит от числа накоплений по строкам.
Данный подход подходит для регистрации таймлапсов в живых клетках с устойчивой интенсивностью на протяжении длительного времени. Достижимая скорость сканирования зависит от яркости окрашивания, скорости обмена красителя и размера изображения.
Плюсы и минусы:
+Наиболее подходит для больших изображений с высоким разрешением
+Совместим с визуализацией живых клеток
+Устойчив к дрейфу предметного столика
-Низкая общая скорость съёмки, требуется автофокус
Подход 2: Медленная скорость обмена красителя
Красители с медленной скоростью обмена лучше подходят для многократной регистрации полного кадра изображения без повторного сканирования строк. Поскольку регистрация полного кадра занимает больше времени, чем сканирование одной линии, предоставляется больше времени для полного восстановления красителя перед началом следующего кадра. Обычно после нескольких циклов сканирования устанавливается равновесие между фотоблеканием и восстановлением, после чего сигнал накапливается для получения яркого финального изображения. Недостатком является возможное смазывание из-за движения (motion blur) из-за более длительного времени накопления сигнала по сравнению с быстрым накоплением по линиям в Подходе 1. Этот эффект становится менее заметным на маленьких изображениях из-за более быстрой регистрации кадра.
Плюсы и минусы:
+Наиболее подходит для фиксированных клеток с низкой интенсивностью окрашивания
+Малые организмы, такие как бактерии
+Смазывание движения: менее подходит для живых клеток, чувствителен к дрейфу столика
– Низкая общая скорость съёмки, требуется фиксатор фокуса
Таблица 1. Примеры меток для STED-PAINT
|
Структура |
Метка |
Быстрая/медленная скорость обмена |
|
ДНК |
HOECHST и конъюгаты HOECHST |
Средняя |
|
Тубулин |
Конъюгаты с таксолом |
Медленная |
|
Актин |
Lifeact |
Быстрая |
|
Мембраны: плазматическая мембрана, митохондрии, эндоплазматический ретикулум, везикулы, липидные капли |
Nile Red |
Быстрая |
|
Широкий спектр мишеней через иммуноокрашивание или токсины |
DNA-PAINT: ДНК, конъюгированная с антителами или токсинами |
Настраиваемая |
Приложение 2: Метки для STED-PAINT
Ключевым требованием для метода STED-PAINT является заменяемость молекул красителя. В то время как традиционное иммуноокрашивание напрямую не совместимо с PAINT, другие распространённые красители демонстрируют временное связывание и отвязывание, что позволяет обмен молекул красителя между связанной фракцией и окружающим буфером. К ним относятся флуоресцентные красители, конъюгированные с токсинами или препаратами, которые легко окрашивают такие структуры, как ДНК, тубулин, актин, а также липофильные красители для окрашивания мембран и другие (см. Табл. 1). В зависимости от проницаемости клетки и токсичности метки, с представленным подходом возможна визуализация как живых, так и фиксированных клеток.
Дополнительно полезно использовать флуорогенные красители, т.е. красители, которые остаются нефлуоресцентными в растворе и становятся флуоресцентными только при связывании с целью. Это снижает фоновый сигнал, исходящий от буфера для визуализации. Тем не менее, многие нефлуорогенные красители с высокой аффинностью к цели также могут обеспечивать хороший сигнал на фоне.
Популярными примерами красителей, совместимых с визуализацией живых клеток методом STED, являются коммерчески доступные силиконовые родамины (SiR) или красители abberior LIVE.
Красители демонстрируют значительные различия в кинетике связывания и отвязывания. Кроме того, в приложениях с живыми клетками концентрация красителя может быть ограничена, что снижает его пополнение из буфера для визуализации. Например, окрашивание SiR-тубулином показывает относительно медленное пополнение при концентрациях, совместимых с ночной регистрацией (обычно около 0,1–1 µM, меньше — если наблюдается веретено деления), что позволяет многократно регистрировать STED-изображения с устойчивой интенсивностью каждые 2–5 минут.
В качестве эмпирического правила, метки с константой диссоциации (KD) в нижнем диапазоне микромолярных концентраций (~1–10 µM) и скоростью отвязывания 1–100 с⁻¹ хорошо подходят для применения в STED-PAINT. Таким образом, большое количество красителей потенциально совместимо с STED-PAINT, и в ближайшем будущем можно ожидать появления ещё большего числа приложений.
